Kloniranje in optimizacija izražanja rekombinantnih proteinov skupkov Neat1 in G4C2 za in vitro opazovanje njihovega nastankaNograšek, Teo (Avtor) Rogelj, Boris (Mentor) ALSFTDnemembranski organeliizražanje proteinovC9orf72skupki G4C2SFPQTDP-43NONOPABPC1FUSPrepisana heksanukleotidna razširitvena mutacija gena C9orf72 predstavlja osnovo za izgradnjo toksičnih nemembranskih skupkov G4C2. Te se pogosto pojavljajo pri družinskih različicah amiotrofične lateralne skleroze in frontotemporalne demence. Mehanizmi nastanka toksičnih skupkov niso dobro poznani in bi lahko bili temelj novega načina zdravljenja bolezni. Za raziskave skupkov so potrebni proteini, ki se kolokalizirajo z mutiranim prepisom in tvorijo skupke G4C2. Zato smo v okviru diplomske naloge pripravili plazmide za in vitro transkripcijo/translacijo in za izražanje proteinov SFPQ, NONO, PABPC1, TDP-43 ter FUS v bakterijah E. coli BL21(DE3). Nemutiranim različicam proteinov smo dodali fuzijski maltoza vezavni protein za povečano topnost konstruktov in fluorescenčni protein NeonGreen. Plazmid je vseboval tudi heksahistidinsko oznako in cepitveno mesto TEV za lažjo izolacijo konstruktov. Proteine SFPQ, PABPC1, TDP-43 in FUS smo izražali pri 37 oC, 1 mM IPTG, tri ure in pri 30 oC, 0,5 mM IPTG, pet ur. Najboljši pogoji za izražanje proteina so bili pri nižji temperaturi in nižji koncentraciji induktorja, ker se je takrat večina proteina nahajala v topni frakciji. V prenizkih količinah za nadaljnjo izolacijo sta se izražala konstrukta SFPQ in SFPQNeonGreen. V nadaljevanju je potrebno preveriti izražanje konstruktov NONO, NONONeonGreen in NeonGreen-PABPC1 ter z uporabo Ni2+ ionov izolirati izražene proteine, da dosežemo naš cilj.20212021-09-10 15:35:00Diplomsko delo/naloga130169VisID: 17383COBISS_ID: 83269635sl