Uporaba sistemov CRISPR/dCas9 za uravnavanje izražanja gena TLR10 v pljučni epitelijski celični liniji A549Potočnik, Ana (Avtor) Ogorevc, Jernej (Mentor) CRISPRdCas9sgRNAizražanje genovSistem CRISPR/Cas9 je uporabno orodje za urejanje genoma in vključuje enoverižno vodilno RNA (sgRNA), ki je komplementarna tarčnemu zaporedju, ter endonukleazo Cas9. Z vnosom mutacij v katalitična mesta Cas9 so raziskovalci ustvarili »mrtvi« Cas9 (dCas9), ki nima endonukleazne aktivnosti. Na dCas9 lahko pripojimo različne transkripcijske dejavnike, s katerimi lahko uravnavamo prepisovanje in posledično tudi izražanje genov. Glede na uporabo različnih transkripcijskih dejavnikov (npr. KRAB, VP160, VPR) in zaporedij sgRNA ločimo različne sisteme, ki so namenjeni aktivaciji (CRISPRa) ali interferenci (CRISPRi) izražanja genov in se med seboj razlikujejo po učinkovitosti. V diplomskem delu smo opisali značilnosti različnih sistemov za regulacijo prepisovanja, fuziji dCas9-VP160 in dCas9-VPR ter štiri različne sgRNA pa smo tudi praktično preizkusili za povečanje izražanja gena TLR10 v celični liniji A549. Po transfekciji celične linije s plazmidi, ki so vsebovali različne sgRNA in aktivatorske fuzije z dCas9, smo iz celic izolirali celokupno RNA. Relativno kvantifikacijo povečanja izražanja tarčnega gena smo določili z metodo RT-qPCR. Rezultati kažejo, da sta oba sistema učinkovita pri aktivaciji izražanja gena TLR10. Potrdili smo tudi, da je sistem CRISPR/dCas9-VPR učinkovitejši od sistema CRISPR/dCas9-VP160, saj prepisovanje gena poveča za približno 15-krat, medtem ko drugi le za največ 1,5-krat. Na raven povečanja izražanja je pomembno vplivalo zaporedje sgRNA. Sistemi CRISPR/dCas9 predstavljajo perspektivno tehnologijo za uravnavanje izražanja genov z najrazličnejšimi načini uporabe na področju funkcijske genomike.20212021-09-10 11:40:00Diplomsko delo/naloga130139VisID: 18201COBISS_ID: 82928131sl