Priprava mišjega katepsina S z avi oznako in njegova karakterizacijaKodrič, Meta (Avtor) Turk, Boris (Mentor) mišji katepsin Savi-oznakabiotinilacijavezavni partnerjiFX-kloniranjeKatepsin S je cisteinska proteaza, ki se izraža v imunskih celicah, kjer kot del endolizosomalnega sistema skrbi za znotrajcelično razgradnjo proteinov ter antigensko predstavitev v kompleksu MHCII. Pomembno vlogo ima tudi pri celični smrti, vnetni signalizaciji v citoplazmi ter pri signalnih in razgradnih poteh, ki potekajo v zunajceličnem okolju. Zaradi stabilnosti v širokem pH območju, široke substratne specifičnosti in posledično visoke proteolizne aktivnosti v različnih celičnih predelkih je nepravilno reguliran katepsin S eden izmed akterjev pri pojavu različnih patoloških stanj, povezanih s kroničnim vnetjem, kot so rak, avtoimunske in kardiovaskularne bolezni ter bolezni pljuč in kosti. Kot takšen predstavlja obetavno terapevtsko in diagnostično tarčo, vendar ga moramo za učinkovito izrabo sprva podrobneje preučiti. Pri tem imajo pomembno vlogo naravno in sintetično pridobljeni vezavni partnerji, ki se specifično vežejo na encim in omogočajo njegovo identifikacijo, vizualizacijo in kvantifikacijo. Pripravimo jih lahko z in vitro selekcijo v vnaprej pripravljeni knjižnici malih molekul oziroma makromolekul, pri čemer se le-te vežejo na imobiliziran tarčni protein - najpogosteje gre za biotiniliran protein, vezan na kolono s (strept)avidinom. Za namen izbora specifičnih vezavnih partnerjev proti mišjemu katepsinu S smo v sklopu diplomskega dela želeli pripraviti mišji katepsin S v fuziji s petnajst aminokislinskih ostankov dolgim peptidnim zaporedjem GLNDIFEAQKIEWHE, imenovanim avi-oznaka. Slednja namreč omogoča mestno specifično biotinilacijo tarčnega proteina s pomočjo encima BirA. Za pripravo zapisa mišjega prokatepsina S z avi-oznako smo uporabili FX-kloniranje. Rekombinantni protein smo izrazili v bakterijskem ekspresijskem sistemu Escherichia coli Rosetta-gami B (DE3) pLysS ter ga izolirali s pomočjo Ni2+-kelatne afinitetne kromatografije. Po aktivaciji smo s titracijo aktivnega mesta z ireverzibilnim inhibitorjem E-64 določili aktivno koncentracijo encima. Z diplomskim delom smo pokazali, da za aktivacijo mišjega prokatepsina S z avi-oznako zadostujejo znižanje pH raztopine na 4,5, dodatek DTT ter zgolj 10-15 minutna inkubacija encima na 37 °C. Z daljšanjem časa inkubacije se zaradi visoke proteolizne aktivnosti encima povečuje stopnja encimske samorazgradnje, kar se odraža v izgubah tarčnega proteina. Kljub precejšnjim izgubam nam je uspelo pripraviti zadostne količine aktivnega mišjega katepsina S z avi-oznako, kar nam omogoča nadaljnjo mestno specifično biotinilacijo encima ter izbor specifičnih vezavnih partnerjev in vitro.20212021-09-09 12:00:07Diplomsko delo/naloga129951VisID: 15841COBISS_ID: 81940483sl