Vloga proteina MPP7 pri diferenciaciji celične linije človeških osteoblastov MG63Dragar, Brina (Avtor) Marc, Janja (Mentor) Lojk, Jasna (Komentor) Osteoporozaosteoblastidiferenciacijamembranski palmitoirani protein 7 (MPP7)alkalna fosfataza (ALP)Vsegenomske študije (GWAS; angl. Genome Wide Association Study) imajo pomembno vlogo pri iskanju novih terapevtskih tarč. S primerjavo pojavnosti genetskih variant pri zdravih in obolelih nam ta način preiskovanja omogoča lokalizacijo mest v genomu in prepoznavo genov (posredno tudi proteinov), ki vplivajo na opazovano lastnost. S pomočjo te metode so ugotovili, da obstaja močna povezava med kostno gostoto in variantami membranskega palmitoiranega proteina 7 (MPP7; angl. Membrane Palmitoylated Protein 7). Kljub temu pa še vedno ni povsem znano, kakšna je njegova vloga pri diferenciaciji in aktivaciji kostnih celic. V sklopu magistrske naloge smo želeli potrditi vlogo proteina MPP7 pri diferenciaciji osteoblastov. Kot celični model smo uporabili celice osteosarkoma MG-63. Primerjali smo stopnjo diferenciacije med celicami z izbitim genom za protein MPP7 (MMP7 KO) in kontrolnimi nespremenjenimi celicami MG-63, ki imajo ohranjeno sposobnost izdelave omenjenega proteina. Pri ocenjevanju stopnje razvitosti osteoblastov smo si pomagali z več različnimi metodami. Stopnjo razvoja smo ocenjevali na podlagi izražanja kazalnih genov, značilnih za diferenciacijo osteoblastov, pri čemer smo uporabili metodo kvantitative verižne reakcije s polimerazo (RT-qPCR). Določili smo izražanje gena za z RUNT povezanim transkripcijskim dejavnikom 2 (RUNX2; angl. Runt-Related Transcription Factor 2), gena za alkalno fosfatazo (ALP; angl. Alkaline Phosphatase), gena za kolagen tipa I alfa 1 verige (COL1A1; angl. Collagen Type I Alpha 1 Chain ) in gena za kostni gama karboksglutamat protein oziroma osteokalcin (BGLAP oz. OC; angl. Bone Gamma-Carboxyglutamate Protein). Izražanje posameznih kazalcev smo nato normalizirali glede na izražanje referenčnega gena za TATA-vezavni protein (TBP, angl. TATA-Box Binding Protein). Določili smo tudi kako se s potekom razvoja osteoblastov spreminja aktivnost encima ALP v celicah in celokupno koncentracijo proteinov v celičnih lizatih v različnih časovnih točkah razvoja. Rezultati so pokazali, da je bilo izražanje genov RUNX2 in COL1A1 značilno višje v MMP7 KO in izražanje gena ALP značilno nižje kot v kontrolnih celicah MG-63. Izražanje gena OC se je bilo obeh celičnih kulturah podobno. Prav tako smo opazili manjšo aktivnost ALP pri celicah z izbitim genom za protein MPP7. Med celičnima linijama ni bilo opaznih razlik v celokupni količini proteinov. Glede na pridobljene rezultate lahko sklepamo, da ima protein MPP7 vpliv na razvoj osteoblastov, saj je v celicah osteosarkoma MG-63 MPP7 KO prišlo do počasnejše diferenciacije celic, kot pri celicah, ki so izražale gen MPP7 (KC). Da bi ugotovili natančen mehanizem, preko katerega je protein MPP7 vpleten v celično diferenciacijo, bo potrebno izvesti dodatne raziskave funkcijske genomike.20212021-09-05 07:45:16Magistrsko delo/naloga129574VisID: 83115sl