Predstavitev proteinskih domen na ogrodju proteinskega origamija iz ovitih vijačnic v obliki tetraedraStrmšek, Žiga (Avtor) Gradišar, Helena (Mentor) Jerala, Roman (Komentor) Proteinski origamiCCPOtetraedrična nano kletkapredstavitev proteinskih domenovite vijačniceGlavna prednost polipeptidih nanostruktur, v primerjavi z večino ostalih polimerov, je tvorba zelo kompleksnih struktur, ki jih določa zaporedje aminokislin. Narava je tekom evolucije raziskala le majhen del teoretično možnih proteinskih zvitij, medtem ko večji del t.i. proteinskega vesolja ostaja neraziskan. Pristopov k razvoju in raziskovanju proteinskih zvitij, ki v naravni niso prisotna, je več. Eden od pristopov k racionalnemu načrtovanju de novo proteinskih zvitij je proteinski origami na osnovi ovitih vijačnic. Proteinski origami iz ovitih vijačnic je načrtovan po principu modularnosti in daljnosežnih interakcij med segmenti ovitih vijačnic. Za to proteinsko zvitje so značilne raznolike poliedrske kletke, pri katerih stranice tvorijo ovite vijačnice, ki so med seboj povezane z gibljivimi proteinskimi povezovalci in s hidrofilno votlino na sredini nanokletke. V doktorskem delu smo raziskali strategije predstavitve proteinskih domen na ogliščih tetraedrične nanokletke z direktno genetsko fuzijo. Delovanje razvitega sistema smo preizkusili s predstavitvijo ene (GFP), dveh (GFP in RFP) ali štirih (štiri GFP ali RFP) proteinskih domen. Na podlagi in silico modeliranja in analize sipanja rentgenskih žarkov pri nizkih kotih se je pokazalo, da je proteinska domena, predstavljena na četrtem oglišču kot fuzija na C-koncu verige, gibljiva. Z zamenjavo mesta fuzije znotraj zaporedja TET12SN smo jo prestavili v notranjost polipeptidne verige in tako zmanjšali njeno gibljivost. Po učvrstitvi vseh štirih domen smo pripravili serijo sedmih konstruktov z različnimi razmerji GFP in RFP, pri katerih smo dokazali uspešno predstavitev proteinskih domen z analitsko gelsko filtracijo in s sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih. TET12SN-RRRR, tetraedrično proteinsko ogrodje, dekoriranim s štirimi RFP proteinskimi domenami, smo uspešno uporabili kot cepivo za predstavitev antigenov. Miši, imunizirane s TET12SN-RRRR so razvila IgG protitelesa proti antigenu RFP hitreje in bolj zanesljivo kot miši, ki so bile imunizirane z monomernim antigenom. Kot alternativno strategijo predstavljanja proteinskih domen na proteinskem origamiju smo TET12SN dekorirali s SpyCatcher/SpyTag proteinskimi domenami, katere smo uporabili za izgradnjo centralnega tetraedra, dekoriranega z (i) enim, (ii) dvema ali (iii) tremi ligandi vključenimi v tetraedrične proteinske kletke. Trenutno sta velikost in kompleksnost poliedričnih proteinskih origamijev omejena z številom dostopnih ortiginalnih ovitih vijačnic. Da bi se izognili tej omejitvi, smo raziskali če lahko uspešno načrtujemo tetraedričen proteinski origami, pri katerem isti par ovitih vijačnic uporabimo večkrat. Dokazali smo, da isti par ovitih vijačnic znotraj tetraedrične nanokletke lahko uporabimo največ dvakrat, ter na tak način uspešno načrtovali in okarakterizirali tetraedrično nanokletko s ponovljenimi pari ovitih vijačnic enkrat (TET12SN(2CC)), dvakrat (TET12SN(22CC)) in trikrat (TET12SN(222CC)). Da bi dokazali modularnost razvitega sistema predstavljanja proteinskih domen na ogliščih, smo pripravili serijo sedmih konstruktov z različnimi razmerji GFP in RFP, le da smo za osnovno ogrodje uporabili TET12SN(22CC). Uspešno izolirane proteine iz te serije smo okarakterizirali z analitsko gelsko filtracijo in sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih, medtem ko smo konstrukt dekoriran z štirimi rdečimi fluorescentnimi proteini še dodatno vizualizirali z krio-elektronsko mikroskopijo. Predstavljen sistem predstavljanja proteinskih domen na ogliščih proteinskih origamijev ima potencial za uporabo v medicinske, industrijske in biotehnološke namene.20212021-08-29 07:15:02Doktorsko delo/naloga129192VisID: 16626COBISS_ID: 131519747sl