Karakterizacija kratkih zaporedij DNK, ki povzročajo kolaps replikacijskih vilicPavleković, Marko (Avtor) Plavec, Janez (Mentor) DNKpodvajanjeNMR spektroskopijaDNK je ena najpomembnejših bioloških molekul, saj opravlja vlogo prenašalke dednih informacij med generacijami. Iz tega razloga je pomembno, da med podvajanjem DNK, oziroma genoma v bioloških sistemih, ne prihaja do napak. V nedavni študiji so s pomočjo inhibicije določenih regulatornih mehanizmov, ki sicer stabilizirajo replikacijske vilice in s tem skrbijo za pravilen potek podvajanja, bila odkrita mesta na DNK, na katerih pogosteje prihaja do kolapsa replikacijskih vilic. Med njimi so zelo pogosta mesta, ki vsebujejo mikrosatelitno zaporedje d(CAGAGG)n. Raziskave kažejo, da bi do kolapsa replikacijskih vilic na teh mestih lahko prišlo zaradi tvorbe sekundarnih struktur DNK, različnih od običajne B-DNK dvojne vijačnice. Strukture, ki jih tvorijo d(CAGAGG)n, še niso poznane, in so predmet nadaljnjih raziskav. V okviru diplomske naloge smo pripravili vzorce za NMR spektroskopijo v raztopini in s pomočjo le-teh naredili karakterizacijo strukture, ki jo tvori mikrosatelitno zaporedje d(CAGAGG)n. Zanimalo nas je, kakšne strukture v raztopini tvorijo krajši fragmenti mikrosatelitnega zaporedja, zato smo se osredotočili na oligonukleotida z dvema mikrosatelitnima ponovitvama: C-las (5'-d(AGGCAGAGGCAG)-3') in G-las (5'-d(AGGCAGAGGGAG)-3'). C-las v centralnem delu vsebuje eno ponovitev mikrosatelitnega zaporedja, na vsakem od koncev pa po polovico druge ponovitve (CAG na 3' in AGG na 5' koncu). Ker nas je zanimalo tudi, kako povečanje deleža purinskih baz v že tako s purinskimi bazami bogatem zaporedju vpliva na zvijanje in strukturne lastnosti, smo se osredotočili tudi na oligonukleotid G-las, v katerem smo glede na C-las uvedli substitucijo citozina v gvanin na mestu 10. S pomočjo NMR spektroskopske analize smo preučili vpliv različnih vrednosti pH in koncentracij KCl v raztopini na zvijanje in strukturo C-las in G-las. Analiza 1H NMR spektrov je pokazala, da C-las in G-las v raztopini brez dodanega KCl najverjetneje tvorita strukturo v obliki lasnice, ki vsebuje nekanonične A¬–G ali/in G–G bazne pare. V prisotnosti KCl v raztopini oligonukleotid C-las ohrani strukturo lasnice. Slednje je v nasprotju z opaženimi karakteristikami G-las, ki se po dodatku KCl zvije v alternativno strukturo, in sicer najverjetneje G-kvadrupleks, na kar sklepamo iz 1H NMR spektralnih signalov, opaženih v karakterističnem območju za G–G bazne pare povezane preko t.i. Hoogsteenovih vodikovih vezi. Nastanek alternativnih struktur G-las po dodatku KCl je časovno odvisen, kar je skladno z intermolekularnim zvitjem, in kaže, da ima substitucija C¬10>G10 in s tem povečanje deleža purinskih baz iz 10/12 na 11/12, ključen vpliv na strukturne lastnosti.20212021-08-27 11:45:00Diplomsko delo/naloga129151VisID: 8801COBISS_ID: 75517443sl