Uvajanje funkcijskih testov delovanja CAR-T in vitroKern, Petra (Avtor) Rajčević, Uroš (Mentor) celična terapijaCAR-TlimfocitielektroporacijaELISAcitokiniCelična terapija s CAR-T se je v preteklih letih izkazala za eno najobetavnejših novih terapij za zdravljenje malignih obolenj. Zaradi uporabe bolniku lastnih (avtolognih) celic, ki predstavljajo spremenljiv dejavnik, se pojavlja potreba po in vitro testiranju aktivnosti celic CAR-T pred vnosom v pacienta. V magistrski nalogi smo s pomočjo elektroporacije v celično linijo humanih limfocitov T CD4+ vnesli receptor CAR anti-CD19 in reporterski protein GFP, nato smo dvojno pozitivne celice ločili s pomočjo FACS in tako dobili homogeno celično kulturo. Celice CAR-T smo izpostavili antigenu CD19. Gojili smo jih v kokulturi s celično linijo humanih limfocitov B, ki izražajo ta antigen. Po 48 urah kokultivacije smo v supernatantu celične kokulture s pomočjo posrednega testa ELISA določali koncentracijo citokinov IL-2, TNF-alfa in IFN-gama. Citokini v supernatanu kokulture so pokazatelj aktivacije celic CAR-T z antigenom CD-19. Celice smo prešteli s pomočjo Bürker – Türkove števne komore pod fluorescentnim in pod svetlobnim mikroskopom, da bi ugotovili, kako se je spremenilo število celic in razmerje med efektorskimi (celice CAR-T, ki zeleno fluorescirajo) in tarčnimi celicami (limfociti B, ki ne fluorescirajo). Z optimalnimi pogoji elektroporacije smo dosegli, da je 22,1 % živih celic izražalo CAR in GFP. V 48 urah kokultivacije se razmerje med efektorskimi in tarčnimi celicami ni spremenilo, prav tako se ni spremenila končna skupna koncentracija celic. Statistično značilno razliko v izločanju citokinov IL-2 in TNF-alfa smo opazili pri razmerju efektorskih in tarčnih celic 1:1. Izločanja IFN-gama z našim testom nismo zaznali. Pokazali smo, da je kokultivacija celic CAR-T skupaj s specifičnim antigenom povzročila izločanje citokinov, ki jih lahko kvantitativno določimo z indirektnim testom ELISA in s tem posredno ovrednotimo pričakovano učinkovitost terapije.[P. Kern]20212021-07-18 07:15:22Magistrsko delo/naloga128535UDK: 606:616-006.6:602.68:602.621(043.2)VisID: 191484COBISS_ID: 72139779sl