Ugotavljanje vpliva izbranih izoflavonoidov na aktivnost kresničkine luciferazeVegelj, Jan (Avtor) Sollner Dolenc, Marija (Mentor) Kenda, Maša (Komentor) izoflavonoidikresničkina luciferazaluciferaza morske mačeheKresničkina luciferaza je reporterski gen, ki se pogosto uporablja na področju raziskovanja vpliva spojin na transkripcijsko aktivnost genov in se njegovo izražanje ugotavlja preko bioluminiscenčne reakcije nastalega proteina. Izraženi protein je dovzeten za potencialni vpliv spojin, med drugim zaviranje in stabilizacijo, kar lahko vodi v lažno pozitivne rezultate. Luciferaza morske mačehe, ki se pogosto uporablja v kombinaciji s kresničkino luciferazo, predstavlja pomembno alternativo le-tej. Ker so izoflavonoidi kot ena izmed skupin naravnih spojin pogosto preiskovanih tudi v testnih sistemih s kresničkino luciferazo, je smiselno, da ovrednotimo njihov vpliv na le-to. V nalogi smo se osredotočili na 11 strukturno različnih izoflavonoidov in ovrednotili njihov vpliv na aktivnost kresničkine luciferaze in luciferaze morske mačehe. Pri tem smo potencialno interferenco kresničkine luciferaze v obliki zaviranja najprej ovrednotili s pomočjo QSAR programa InterPred, ki je napovedal veliko verjetnost zaviranja za 7 od 11 izoflavonoidov. Z novo metodo in vitro, ki temelji na osnovi luciferaznega testa na lizatu celične linije AR-EcoScreen, smo preverili zaviranje obeh reporterskih proteinov. Pri tem smo najprej testirali spojine pri 1, 10 in 100 µM koncentraciji, čemur je v primeru zaviralne aktivnosti sledilo še testiranje pri dodatnih koncentracijah in določitev IC50. Sedem od 11 izoflavonoidov je zaviralo kresničkino luciferazo, pri čemer smo pri primerjavi z rezultati programa InterPred prišli do zaključka, da program pravilno napove zaviralno aktivnost. Nobeden izmed izbranih izoflavonoidov ni zaviral luciferaze morske mačehe in vitro. Za najbolj močne zaviralce smo v obliki prirejenega testa in vitro vrednotili tudi temperaturno stabilizacijo kresničkine luciferaze. Vendar pa z gotovostjo težko potrdimo, da so pridobljene vrednosti posledica stabilizacije proteina, saj ima ta metoda nekaj pomanjkljivosti. Zaviranje kresničkine luciferaze smo raziskali še bolj podrobno s pomočjo molekulskega sidranja in potrdili, da se aktivni izoflavonoidi vežejo v luciferinski žep proteina ter preučili odnos med strukturo in aktivnostjo aktivnih izoflavonoidov. Z molekulskim sidranjem smo tudi potrdili, da izbrani izoflavonoidi ne zavirajo luciferaze morske mačehe. Potrdili smo zaviralno aktivnost nekaterih izbranih izoflavonoidov, kar lahko zaradi stabilizacije pojasni višje odzive celičnih linij s kresničkino luciferazo v preteklih študijah. Pri testiranju vpliva izoflavonoidov na transkripcijsko aktivnost izbranih genov bi bila tako bolj ustrezna uporaba luciferaze morske mačehe.20212021-07-08 08:45:09Magistrsko delo/naloga128303VisID: 81162sl