Vpliv malih nekodirajočih RNA iz skupine YRNA in vtRNA na retrotranspozicijo LINE1Novak, Valentina (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) retrotranspozon LINE1vaultRNAYRNALINE1 je avtonomni transpozicijski element iz skupine dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Njegove kopije sestavljajo približno 17 % človeškega genoma. Povečanje frekvence retrotranspozicije LINE1 je prisotno pri več patoloških stanjih, kot so rak ter nekatere avtoimunske in nevrološke bolezni. V procesu retrotranspozicije LINE1 sodeluje RNA vezavni protein ORF1p. YRNA in vaultRNA sta skupini malih nekodirajočih molekul RNA, katerih vloge še niso dobro poznane. Na podlagi rezultatov predhodne analize molekul RNA, ki se vežejo na ORF1p, smo v magistrski nalogi želeli ovrednotiti interakcijo človeških vaultRNA1-1 (vtRNA1-1) in RNY4 s proteinom ORF1p ter njun morebiten vpliv na retrotranspozicijo. Interakcijo endogenega ORF1p iz človeških celičnih linij 2102Ep in NTERA-2 s preiskovanima RNA smo najprej eksperimentalno potrdili s testom RNA-»pull down«. Za preučevanje vplivov v sesalskih celicah smo pripravili vektor pcDNA3.1-U6, ki vsebuje promotor U6 za vezavo RNA-polimeraze III. V pripravljeni vektor smo nato vstavili zapise za vtRNA1-1 in RNY4 ter ustreznost konstruktov za prekomerno izražanje danih RNA v celicah HeLa preverili z metodo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo po reverzni transkripciji (RT-qPCR). S pomočjo konstruktov smo preučili vpliv povečanja ravni vtRNA1-1 ali RNY4 na proces retrotranspozicije LINE1. Za ta namen smo uporabili test retrotranspozicije, kjer vključitev nove kopije retrotranspozona zaznamo preko reporterja EGFP (ojačan zeleni fluorescenčni protein) z meritvijo na pretočnem citometru. Test je pokazal, da povečanje koncentracije RNY4 zmanjša raven retrotranspozicije, medtem ko povečanje koncentracije vtRNA1-1 ni imelo signifikantnega vpliva. V zadnjem delu smo preučili še celično lokalizacijo proteina ORF1p in avtofagnega receptorja SQSTM1 (p62), na katerega po podatkih iz literature regulatorno vpliva vtRNA1-1. Kolokalizacije teh proteinov v celicah HEK 293T nismo zaznali, niti v pogojih oksidativnega stresa ali ob inhibiciji avtofagije. Rezultati prispevajo vpogled v RNA vezavne lastnosti proteina ORF1p in vplive nekodirajočih RNA na retrotranspozicijo LINE1.20212021-07-02 14:10:22Magistrsko delo/naloga128111VisID: 11730COBISS_ID: 70950659sl