Biokemijska karakterizacija in primerjava lastnosti treh izbranih rekombinantno izraženih metakaspaz iz organizmov Chlamydomonas reinhardtii in Guillardia thetaŠtrancar, Vida (Avtor) Klemenčič, Marina (Mentor) metakaspazecisteinske proteazeSERPINChlamydomonas reinhardtiiGuillardia thetaRegulirana celična smrt (RCD) je evolucijsko ohranjen proces, ki je bil opažen pri posameznih predstavnikih vseh živečih organizmov. Sprva so ta pojav pripisovali le evkariontskim večceličnim organizmom, vendar so kasneje opazili, da do tega pojava prihaja tudi pri enoceličnih organizmih kot so kvasovke, alge in bakterije. Pri izvedbi RCD pri živalskih organizmih so ključne cisteinske endopeptidaze kaspaze. Pri ostalih organizmih kaspaze niso prisotne, so pa prisotni njim homologni proteini, metakaspaze. Kljub strukturni homologiji med kaspazami in metakaspazami se ti dve skupini po funkcionalnih lastnostih bistveno razlikujeta. Metakaspaze namreč cepijo substrate za pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki ter za svojo katalitično aktivnost ne potrebujejo oligomerizacije. Večina metakaspaz je katalitično aktivna le v prisotnosti kalcijevih ionov. Glavni namen tega dela je bil izraziti, očistiti in okarakterizirati predstavnice vseh treh tipov metakaspaz. Metakaspazi GtMC1 (tip I) in GtMC2 (tip III) izvirata iz sekundarnega endosimbionta, alge Guillardia theta. CrMC2 je metakaspaza tipa II iz zelene alge Chlamydomonas reinhardtii. Proteolitična aktivnost vseh treh metakaspaz je podobna, saj proteinske substrate cepijo le v prisotnosti kalcijevih ionov. Vse tri proteaze cepijo majhna sintetična substrata Z-FR-AMC in Z-RR-AMC, vendar se njihove Michaelisove konstante precej razlikujejo. V delu smo preverjali tudi inhibitorno sposobnost proteinskega inhibitorja CrSERPIN-a ob spremljanju hidrolize majhnega sintetičnega substrata. CrSERPIN najbolj inhibira CrMC2, najmanj pa GtMC2. Testirali smo tudi štiri različne tetrapeptidne sonde za detekcijo metakaspazne aktivnosti, ki se ireverzibilno vežejo v aktivno mesto metakaspaz. Sonde EKAK-AOMK, EKTK-AOMK, IRSK-AOMK in IISK-AOMK so bile načrtovane tako, da so specifične za metakaspaze. Njihov peptidni del je prilagojen tako, da je čimbolj podoben substratni specifičnosti že okarakteriziranih metakaspaz. Konstante inaktivacije sond so najvišje za metakaspazo CrMC2, iz česar sklepamo, da so sonde najbolj primerne za detekcijo metakaspaz tipa II. Sonda z najvišjimi konstantami inaktivacije za posamezno metakaspazo je IRSK-AOMK, kar kaže na to, da imajo vse tri metakaspaze podobno kemijsko okolje vezavnega žepa za substrat.20212021-06-24 08:35:01Magistrsko delo/naloga127825VisID: 10021COBISS_ID: 70487043sl