Opredelitev vloge protismernega zapisa RNA gena C9orf72 mutiranega pri amiotrofični lateralni sklerozi in frontotemporalni demenciMalnar, Mirjana (Avtor) Rogelj, Boris (Mentor) ALSFTDprotismerna RNAFARSAaminoacilacija tRNASFPQDPRUvod: Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) in frontotemporalna demenca (FTD) sta hitro napredujoči, neozdravljivi in smrtonosni nevrodegenerativni bolezni. Najpogostejši genetski vzrok ALS in FTD je mutacija v genu C9orf72 (angl. chromosome 9 open reading frame 72). Mutacija se kaže v obliki razširjenih ponovitev zapisa G4C2, katerih število pri obolenju doseže več 100 lahko tudi več 1000 ponovitev. Pri ALS in FTD naj bi mutacija povzročala: haploinsuficienco proteina C9orf72, z RNA posredovano toksičnost smernih in protismernih prepisov RNA razširjenih ponovitev ter toksičnost proteinov z dipeptidnimi ponovitvami (DPR), ki se prevedejo iz smernih in protismernih zapisov RNA. Z RNA posredovana toksičnost je posledica sekvestracije proteinov na skupke smernih in protismernih zapisov RNA, kar onemogoči njihove normalne funkcije v celici. Obstaja veliko raziskav o vezavi različnih proteinov na smerne zapise RNA. Vezava proteinov na protismerne zapise je raziskana v veliko manjši meri. Veliko raziskav je usmerjenih tudi v preučevanje DPR-jev in z njimi povezanih okvar celičnih procesov. Vse več pozornosti se namenja tudi povezavi med vsemi tremi mehanizmi, ki jih povzroča mutacija v genu C9orf72 ter na njihovo skupno vlogo v patologiji bolezni. Namen dela in hipoteza: Tako smerni kot protismerni zapisi RNA razširjenih ponovitev G4C2 v genu C9orf72 vežejo nase različne proteine, kar prispeva k patologiji ALS in FTD. Ker so v večji meri raziskani le smerni zapisi RNA smo se v naši raziskavi osredotočili na manj raziskane protismerne zapise RNA ponovitev v genu C9orf72. Hipoteza, na kateri sloni raziskava, se glasi: Protismerni zapis RNA mutacije v genu C9orf72 veže za celico pomembne proteine, kar je lahko povezano s patologijo ALS in FTD. Namen dela je bil identificirati proteine, ki vežejo protismerni zapis RNA razširjenih ponovitev mutacije v genu C9orf72 ter opredeliti potencialno vlogo teh interakcij pri patologiji ALS in FTD. Poleg tega smo v nalogi ovrednotili vpliv proteina SFPQ (angl. splicing factor proline and glutamine rich), za katerega je znano, da veže smerne zapise RNA ponovitev v genu C9orf72, na število jedrnih skupkov tako smernih kot protismernih zapisov RNA ponovitev v genu C9orf72 ter na raven izražanja DPR-jev. Metode dela: Za identifikacijo proteinov, ki vežejo dolge ponovitve protismerne RNA iz razširjenih ponovitev G4C2 v genu C9orf72, smo vzpostavili test RNA “pull down”. Interakcijo protismerne RNA z identificiranimi proteini smo preverili na celicah s prisotno mutacijo v genu C9orf72 s pomočjo RNA fluorescenčne in situ hibridizacije (RNA-FISH) v kombinaciji z imunocitokemijo (ICC) in analizo kolokalizacije fluorescenčnega signala skupkov RNA in izbranih proteinov. Kot prvi smo optimizirali metodo RNA-protein PLA (angl. proximity ligation assay) za analizo interakcij protismernih ponovitev RNA in proteinov v citoplazmi tudi izven znanih jedrnih skupkov RNA. Optimizirali smo protokol za preverjanje stopnje aminoacilacije tRNA v kombinaciji s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo (qPCR) in naše rezultate uspešno analizirali z metodo ddCt. Vpliv ravni izražanja proteina SFPQ na število skupkov RNA in na izražanje DPR-jev v celicah smo ovrednotili v vzpostavljenih celičnih modelih s prekomerno izraženim ali utišanim proteinom SFPQ. V teh celičnih modelih smo izražali smerne oziroma protismerne zapise razširjenih ponovitev gena C9orf72. Za prekomerno izražanje proteina SFPQ smo uporabili transfekcijo, za njegovo utišanje pa transdukcijo celic z lentivirusnimi delci. Raven izražanja A podenote fenilalanin-tRNA sintetaze (FARSA), SFPQ in DPR-jev smo preverili s prenosom western in točkovnim nanosom vzorcev z analizo intenzitete končnega protitelo-antigen signala. Detekcijo posameznih skupkov RNA in proteinov ter signala RNA-protein z metodo PLA smo izvedli s konfokalno fluorescenčno mikroskopijo. Kvantifikacija je bila izvedena s programom ImageJ. Za statistično analizo smo uporabili Studentov t-test. Rezultati in razprava: Pokazali smo, da C4G2 ponovitve RNA vežejo proteine vpletene v različne celične procese. Identificirani proteini sodelujejo pri sestavi in stabilnosti citoskeleta, transportu RNA in proteinov po aksonih in dendritih (CYFIP1/2, TAOK1), pri procesiranju in transportu molekul RNA (HNRNPL), pri sintezi proteinov (FARSA/B), pri funkciji mielinizirajočih celic (CNP), pri biogenezi ribosomov in pri preverjanju kvalitete proteinov (NPM1). Identificirani proteini so bili že povezani z različnimi nevrodegenerativnimi boleznimi, med njimi tudi z ALS. V nadaljevanju raziskave smo se osredotočili na citoplazemski interaktor fenilalanin-tRNA sintetazo (FARS), ki je sestavljena iz podenote ? (FARSA), katere naloga je vezava ustrezne aminokisline na tRNA in podenote ß (FARSB), katere naloga je odstranitev nepravilno pripete aminokisline iz tRNA. Z namenom preučevanja citoplazemskih interakcij protismerne RNA C4G2 s proteini v celičnih modelih, smo optimizirali protokol RNA-protein PLA detekcije. Interakcije RNA C4G2 s FARSA smo uspeli potrditi v treh različnih celičnih linijah z mutacijo v genu C9orf72 (fibroblastih, limfoblastih in iPSC-ih). Okvare v delovanju FARSA povzročene z vezavo na C4G2 RNA bi lahko vodile v znižano aminoacilacijo Phe-tRNA. Zato smo optimizirali protokol za določanje stopnje aminoacilacije tRNA, s katerim smo v limfoblastih s prisotno mutacijo v genu C9orf72 odkrili bistveno znižanje ravni aminoacilacije Phe-tRNA, v primerjavi s kontrolnimi limfoblasti. Napake v delovanju aminoacil-tRNA sintetaz (ARS) lahko vodijo v napačno zvijanje in kopičenje proteinov, kar je značilno za nevrodegenerativne bolezni. Poleg tega imajo ARS-i še veliko nestandardnih funkcij, ki bi bile lahko prav tako prizadete ob interakciji teh proteinov s ponovitvami C4G2 RNA v celicah. V drugem delu naloge smo proučili vpliv proteina SFPQ, povezanega z nevrodegeneracijo, na tvorbo skupkov smerne in protismerne RNA razširjenih ponovitev gena C9orf72 in na sintezo DPR-jev. Znižana raven izražanja proteina SFPQ zniža število skupkov smerne in v manjši meri tudi protismerne RNA v celici, ter zniža raven izražanja DPR-jev. Prekomerno izražanje proteina SFPQ pa poveča število skupkov smerne in protismerne RNA ter sintezo DPR-jev. SFPQ je znan interaktor smerne RNA razširjenih ponovitev gena C9orf72, mi pa smo pokazali, da ne veže protismerne RNA razširjenih ponovitev gena C9orf72. S tem lahko razložimo manjši vpliv ravni izražanja SFPQ na skupke protismerne RNA. Pokazano je bilo, da protein SFPQ uravnava prepisovanje genov, ki imajo kompleksno sekundarno strukturo na ravni DNA. Predvidevamo, da posledično lahko vpliva tudi na prepisovanje razširjenih ponovitev gena C9orf72, ki prav tako tvorijo sekundarne strukture na ravni DNA. To pojasni vpliv ravni izražanja proteina SFPQ na število tako smernih kot protismernih skupkov RNA ponovitev C9orf72 ter tudi na sintezo DPR-jev, ki smo jo opazili. Spremenjena sinteza DPR-jev pa bi bila lahko uravnavana tudi na ravni translacije, saj je SFPQ vpleten tudi v mehanizme translacije. Zaključki in znanstveno-raziskovalni pomen študije: Določili smo nove proteine, ki vežejo manj raziskane protismerne zapise RNA razširjenih ponovitev gena C9orf72, ki so vpleteni v različne celične procese. Okvare funkcije teh proteinov zaradi njihove vezave na protismerno RNA bi lahko imele značilne posledice za delovanje nevronov. Prvi smo odkrili interakcijo proteina FARS s protismernimi RNA razširjenih ponovitev gena C9orf72 in okvaro aminoacilacije tRNA v celicah z mutacijo v genu C9orf72 in tako pomembno prispevali k razumevanju okvare mehanizmov in prizadetosti celičnih procesov pri ALS in FTD s prisotno mutacijo v genu C9orf72. Odkriti mehanizem odpira nove možnosti za terapevtske pristope pri ALS in FTD obolenjih. Za ovrednotenje citoplazemske interakcije protismerne RNA, smo prvi v ta namen optimizirali in uporabili metodo RNA-protein PLA. Do sedaj so metode omogočale le analize interakcij razširjenih ponovitev RNA znotraj jedra. Z našo optimizirano RNA-protein PLA metodo pa smo omogočili tudi analize interakcij v citoplazmi. S tem smo pomembno prispevali k metodološkem pristopu analize interakcij razširjenih ponovitev RNA mutacije v genu C9orf72 z različnimi celičnimi proteini. Prav tako smo pokazali, da raven izražanja proteina SFPQ vpliva na tvorbo skupkov tako smerne kot protismerne RNA in na sintezo DPR-jev. S tem smo pripevali k razumevanju vloge proteina SFPQ pri bolezni ALS in FTD in njegovega vpliva na toksične mehanizme, ki jih mutacija v genu C9orf72 proži. Uravnavanje ravni SFPQ-ja in z njim povezanih mehanizmov je potencialen terapevtski pristop za zdravljenje ALS in FTD s prisotno mutacijo v genu C9orf72.20212021-06-01 11:39:05Doktorsko delo/naloga127270VisID: 16447COBISS_ID: 137789443sl