Priprava in karakterizacija mestno specifičnih pegiliranih konjugatov interferona alfa-2bKusterle, Mateja (Avtor) Štrukelj, Borut (Mentor) Gaberc-Porekar, Vladka (Komentor) biološka zdravilainterferonpegintronmetodekonjugatianalizapegililacija interferona alfaProteini se vse bolj uveljavljajo kot zdravilne učinkovine v terapiji mnogih patofizioloških stanj. Navadno imajo biološka zdravila poleg svoje velike učinkovitosti tudi veliko neugodnih lastnosti, zaradi katerih jih ne moramo obravnavati kot optimalne zdravilne učinkovine. Biofarmacevtiki prve generacije so zdravilne učinkovine, ki nadomeščajo naravne proteinske molekule in izkazujejo kemijsko in fizikalno nestabilnost, omejeno topnost, kratek razpolovni čas, proteolitsko nestabilnost, imunogenost in toksičnost. Vse navedene pomanjkljivosti navadno izboljša konjugacija proteina s PEG verigo - pegilacija. Slaba lastnost pegiliranih konjugatov je skoraj vedno zmanjšana biološka učinkovitost ˝in vitro˝, ki pa jo kompenzirajo v pogojih ''in vivo'' navadno zelo izboljšane farmakokinetične lastnosti. Podaljšanje razpolovnega časa v telesu temelji predvsem na povečanju hidrodinamskega radija proteina zaradi pripete PEG verige. Pripravili smo serijo različnih pegiliranih oblik rekombinantenga humanega inerferona alfa 2b (IFN), pridobljenega v bakteriji E. coli, in pegilirane konjugate preučili. Z uporabo N -terminalne mestno specifične pegilacije smo se izognili nastanku številnih pozicijskih izomer in vplivu prekrivanja različnih delov proteinske molekule s PEG verigo, kar omogoča lažje in natančnejše preučevanje zgolj vpliva velikosti in oblike PEGa. Specifičnost pegilacije za N-konec smo dokazali s peptidnim kartiranjem. V prvem delu naloge je predstavljena analiza velikosti oziroma hidrodinamskega radija ali navidezne molekulske mase pegiliranih konjugatov z različnimi metodami: gelska kromatografija (SE-HPLC), gelska elektroforeza (SDS-PAGE) ter dinamično sipanje svetlobe (DLS). Uporabili pa smo tudi za ta namen na videz manj primerni metodi reverzno fazno kromatografijo visoke ločljivosti (RP-HPLC) in analitsko kationsko kromatografija (CE-HPLC). Ugotovili smo, da najpogosteje uporabljena standardna analitska metoda za ugotavljanje hidrodinamskega radija – SE-HPLC, ne detektira razlik v velikosti med konjugati z linearno in razvejan PEG verigo, medtem ko smo z metodo DLS določili za konjugate z razvejanimi PEGi manjši hidrodinamski radij, kot pri konjugatih z linearnimi PEGi z isto molekulsko maso. Metoda CE-HPLC, ki temelji na ionskih interakcijah, je pokazala linearno odvisnost retenzijskega časa od dolžine linearnega PEG-IFN konjugata, medtem ko so konjugati z razvejano PEG verigo od te linearnosti izrazito odstopali. Konjugati, pegilirani na istem mestu, imajo isti neto naboj, razlike v retenzijskem času konjugatov pa so pokazale na izrazit vpliv velikosti in razvejanosti PEG verige, kar je verjetno posledica senčenja površine proteina in s tem manjše interakcije z matriksom. RP-HPLC metoda, ki temelji na hidrofobnih interakcijah z molekulami, je dala nepričakovan rezultat, saj so se pegilirani konjugati, ki naj bi bili zaradi vezave vode na PEG verigo izrazito hidrofilni, pokazali povečano retenzijo glede na povečano molekulsko maso PEG verige. Raziskave smo nadaljevali s študijem razmerij med strukturo in funkcijo, pri čemer smo velikost in obliko pegiliranih konjugatov interferona povezovali z ugotovitvami testiranj biološke aktivnosti ˝in vitro˝ in farmakokinetičnim obnašanjem, določenim na živalskem modelu (podgana). Poskusi ''in vivo'' so pokazali, da sta farmakokinetična profila Pegasya® (interferon α-2a nespecifično monopegiliran z 40 kDa razvejanim PEGom) in našega konjugata, konjugiranega s 45 kDa razvejanim PEG reagentom, primerljiva. Izrazito linearno povezavo med prej naštetimi analitskimi metodami in meritvami biološke aktivnosti ˝in vitro˝ smo v seriji N-terminalno pegiliranih konjugatov IFN ugotovili zgolj za metodo CE-HPLC. Ta ugotovitev kaže, da je senčenje površine proteina ključen faktor za biološko aktivnost ˝in vitro˝ in da je za serijo specifično monopegiliranih konjugatov z metodo CE-HPLC možno biološko aktivnost ˝in vitro˝ napovedati.[M. Kusterle]20092021-05-14 11:27:55Doktorska disertacija127045UDK: 577COBISS_ID: 2591857sl