Razvoj peptidnih inhibitorjev lipaz in fosfolipaz z metodo bakteriofagnega prikazaLunder, Mojca (Avtor) Kreft, Samo (Mentor) peptidne knjižnicezdravljenje debelostifarmakologijabakteriofagna knjižnicabakterijska knjižnicaBiološke knjižnice naključnih peptidov, predstavljenih na površini organizmov, nam omogočajo sistematično proučevanje interakcij ciljnih makromolekul. Peptidni modulatorji terapevtsko zanimivih ciljnih proteinov imajo v sodobnem načrtovanju učinkovin vse pomembnejšo vlogo. V prvem delu smo vpeljali, razvili in optimirali metodologijo bioloških kombinatoričnih knjižnic z uporabo streptavidina kot modelne ciljne makromolekule. V drugem delu pa smo jo uporabili kot orodje za identifikacijo strukturno in funkcionalno optimalnih peptidnih ligandov izbranih ciljnih makromolekul. Primerjalno smo ovrednotili dva tipa bioloških knjižnic, bakterijsko in bakteriofagno predstavitveno knjižnico. Na podlagi lastnih eksperimentov in podatkov, objavljenih v literaturi, smo zaključili, da so bakteriofagne predstavitvene knjižnice sicer tehnično zahtevnejše, vendar v večini primerov vodijo v uspešnejšo selekcijo. Za rešetanje in ovrednotenje posameznih bakteriofagnih klonov smo primerjali dve metodi, encimskoimunski test na trdnem nosilcu in površinsko plazmonsko resonanco. Obe metodi je mogoče uspešno uporabiti za določanje vezavnih lastnosti bakteriofagnih klonov, izbira pa temelji na naravi in količini ciljne makromolekule ter nenazadnje na opremi, ki nam je na voljo. Predvsem kadar je količina ciljne makromolekule omejujoč dejavnik, je metoda izbora površinska plazmonska resonanca, saj raznoliki senzoski čipi omogočajo pritrditev katerekoli makromolekule, ne glede na njene fizikalno-kemijske lastnosti. V tehnologijo bakterifagnega prikaza smo vpeljali uporabo ultrazvoka, ki pri eluciji pripomore tako k pretrganju interakcij med tarčo in peptidom na bakteriofagu, kot tudi desorpciji tarčnega proteina skupaj z bakteriofagom s trdnega nosilca. Uvedba tega inovativnega postopka v afinitetne selekcije bo brez dvoma prispevala k razvoju tehnologije bakteriofagnih predstavitvenih knjižnic. Tehnologijo bioloških peptidnih knjižnic smo uporabili za razvoj novih ligandov in potencialnih inhibitorjev encimov, ki sodelujejo pri razgradnji in absorpciji maščob v prebavnem traktu (pankreasne lipaze, pankreasne fosfolipaze A2). Uporabili smo knjižnico naključnih, cikličnih heptapeptidov in linearnih dodekapetidov izraženih na bakteriofagih. Naredili smo več neodvisnih selekcij, pri katerih smo spreminjali načine spiranja in elucije. Inhibicijo pankreasne lipaze smo dosegli s peptidom D23 (navidezna konstanta inhibicije 16 μM). Ligandi pankreasne fosfolipaze A2 in sorodne fosfolipaze, amoditoksina C, ki smo jih izolirali z različnimi selekcijskimi protokoli, jasno kažejo afiniteto do obeh encimov, neodvisno od ciljne molekule uporabljene pri selekciji. Navkljub vezavi na tarčna proteina, pa peptidi ne vplivajo na njuno aktivnost. Peptidi, pridobljeni s to metodologijo, so ligandi določenih mest ciljnega proteina in lahko predstavljajo spojine vodnice pri razvoju novih učinkovin. Njihova uporabna vrednost je predvsem v sposobnosti selektivnih interakcij s ciljnimi proteinskimi makromolekulami.[M. Lunder]20082021-05-13 10:46:19Doktorska disertacija127019UDK: 577.115COBISS_ID: 2277233sl