Kvantitativno določanje vsebnosti prostih aminokislin v bioprocesni brozgi z avtomatsko derivatizacijo na visokotlačnem tekočinskem kromatografuUrh, Maja (Avtor) Jamnik, Polona (Mentor) Vidmar, Tilen (Komentor) aminokislinekromatografska metodarazvojOPAFMOCavtomatizacijaAnalitska metoda, ki bi omogočala določanje prostih aminokislin med bioprocesom v bioprocesni brozgi, bi pripomogla k hitrejši optimizaciji in prilagajanju njene sestave. S tem bi znatno vplivali na izboljšanje bioprocesa in kakovosti končnega produkta. V ta namen smo v okviru magistrske naloge testirali metodo, kjer se aminokisline najprej derivatizirajo z reagentoma orto‐ftaldialdehidom (OPA) in 9-fluorenilmetil kloroformatom (FMOC). Sledi ločba derivatov z reverzno fazno kromatografijo na ultra visokotlačnem tekočinskem kromatografskem (UHPLC) sistemu. Metodo smo optimizirali s ciljem doseči čim višjo stopnjo avtomatizacije, zato vsi koraki (redčenje, derivatizacija, ločba in detekcija) potekajo direktno na UHPLC sistemu. Ustreznost metode smo preverili z validacijskimi parametri. Z rezultati smo pokazali, da smo uspešno optimizirali in dosegli zastavljeno avtomatizacijo metode, prav tako smo potrdili doseženost validacijskih parametrov z uporabo standardnih raztopin. Pri analizah bioprocesnih vzorcev smo potrdili primernost metode za določanje primarnih aminokislin in oteženo kvantifikacijo sekundarnih aminokislin. Vzrok so nespecifični kromatografski vrhovi in variabilnost kromatograma aminokislin, derivatiziranih s FMOC reagentom. Za najbolj problematične nespecifične vrhove smo ugotovili in potrdili, da so posledica samega OPA reagenta in reakcij OPA reagenta z neznanimi komponentami v bioprocesni brozgi. Kljub temu ostaja težava pri kromatogramu sekundarnih aminokislin, saj kromatografski vrhovi niso optimalno ločeni, njihova detekcija pa je variabilna. Metoda potrebuje nadaljnjo optimizacijo, da bo dosegla vse kriterije sprejemljivosti določanja celotnega željenega spektra aminokislin (primarne in sekundarne aminokisline) z željeno avtomatizacijo.[M. Urh]20212021-04-27 12:05:34Magistrsko delo/naloga126532UDK: 606:62:577.112.34:602.4:543.544(043.2)VisID: 191154COBISS_ID: 61759491sl