Identifikacija človeških citoplazemskih proteinov, ki interagirajo z dvema derivatoma pirazolaStojkovska, Milena (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) proteinske interakcijemalomolekulski ligandafinitetna kromatografijapirazolni derivatiISOC2Identifikacija malih molekul, ki interagirajo z biološkimi makromolekulami, je eden temeljnih pristopov pri iskanju novih zdravilnih učinkovin. Pri tem ponavadi izhajamo iz znane makromolekule in odkrivamo male molekule, ki z njo interagirajo. Alternativno pa lahko iščemo tudi makromolekule, ki interagirajo z neko izbrano malo molekulo, katere biološka (fenotipska) aktivnost je lahko znana ali pa ne. Najbolj razširjena tehnika, ki jo lahko uporabimo v ta namen, je afinitetna kromatografija. Cilj magistrske naloge je bil identificirati proteine, ki specifično interagirajo z dvema podobnima malima molekulama, 4-(2-aminoetil)-1-cikloheksil pirazol-5-olom (ligand 1) in 4-(2-aminoetil)-1-fenil pirazol-5-olom (ligand 2), ki sta bili sintetizirani na Katedri za organsko kemijo FKKT UL. Mali molekuli smo imobilizirali na afinitetni nosilec NHS-activated Sepharose™ 4 Fast flow in pripravljeni koloni uporabili za izolacijo tarčnih proteinov. Preiskovani vzorec je bil lizat celic človeških monocitov U937, gojenih v suspenzijski kulturi. Analize NaDS-PAGE so pokazale, da se liganda med seboj razlikujeta v naboru interagirajočih proteinov. Eluate s kolone z ligandom 1 smo analizirali z masno spektrometrijo in na ta način identificirali enega od interagirajočih proteinov kot ISOC2 – slabo poznan človeški protein, ki vsebuje izohorizmatazno domeno in interagira z zaviralcem tumorjev p16INK4a. Če je ISOC2 regulator p16INK4a, je potencialna nova tarča za razvoj nove strategije za zdravljenje raka in staranja, ligand 1 pa prva znana mala molekula, ki se nanj specifično veže. Za namen podrobnejše karakterizacije interakcije in vitro smo v okviru tega dela pripravili tudi sistem za izražanje človeškega ISOC2 v bakteriji E. coli. Analiza rekombinantnega proteina s kromatografijo z ločevanjem po velikosti je pokazala, da je rekombinanten protein najverjetneje homodimer, po čemer se razlikuje od svojih homologov, ki so večinoma homotetrameri.20212021-04-22 14:34:59Magistrsko delo/naloga126447VisID: 6713COBISS_ID: 65740035sl