Kombiniran pristop k študiju kemizma razgradnje venetoklaksa z in silico orodji in načrtovanimi stresnimi testiŽigart, Nina (Avtor) Časar, Zdenko (Mentor) Ilaš, Janez (Komentor) venetoklaksrazgradni produktistresno testiranjestabilnost zdravilnih učinkovinin silicorazvoj analizne metodetekočinska kromatografijaStabilnost zdravilne učinkovine vpliva na njeno varnost in učinkovitost, zato je ključna pri razvoju zdravil. Pri razvoju zdravil je potrebno testiranje stabilnosti in identifikacija znatnih razgradnih produktov zdravilne učinkovine. Za poglobljeno razumevanje stabilnosti zdravilne učinkovine se izvaja dolgoročno in pospešeno testiranje stabilnosti. Pospešeno testiranje traja 6 mesecev dolgoročno pa 12 mesecev, kar znatno podaljšuje razvoj zdravila. Zgodnje napovedovanje in identifikacija možnih nečistot v zdravilu je zato pomembna pri farmacevtskem razvoju. Stresni testi zdravilne učinkovine lahko pomagajo pri zgodnji identifikaciji možnih razgradnih produktov, kar pripomore pri določevanju razgradnih poti in intrinzične stabilnosti molekule. S stresnimi testi si pomagamo tudi pri razvoju analiznih metod za testiranje stabilnosti zdravilne učinkovine. Pred izvedbo stresnih testov navadno skušamo napovedati razgradne produkte, pri čemer si pomagamo z literaturnimi podatki in kemijskim znanjem. Vedno bolj se uporabljajo tudi napovedna orodja oz. in silico orodja, ki napovedujejo razgradne produkte in nam dajo začetno sliko glede stabilnosti molekule pod različnimi pogoji. Taka orodja so lahko v pomoč tudi pri identifikaciji razgradnih produktov, pridobljenih s stresnim testiranjem. Venetoklaks je selektiven zaviralec anti-apoptotične beljakovine limfoma celic B (Bcl)-2. Je prva registrirana zdravilna učinkovina s to proteinsko tarčo. Leta 2016 je bil odobren za zdravljenje bolnikov s kronično limfocitno levkemijo v Združenih državah Amerike. Ker je venetoklaks relativno nova zdravilna učinkovina, v literaturi še ni bilo veliko znanega glede njegove stabilnosti. Prav tako ni bilo moč najti analiznih metod za testiranje stabilnosti venetoklaksa. Kot edina zdravilna učinkovina v skupini zaviralcev proteina Bcl-2 ima strukturo, ki se razlikuje od drugih znanih zdravilnih učinkovin. Tako je tudi stabilnost molekule na prvi pogled težje napovedljiva. Namen našega dela je bila določitev razgradnih produktov venetoklaksa z uporabo kombiniranega pristopa z in silico orodji in stresnimi testi ter razvoj analizne metode za spremljanje venetoklaksa in njegovih razgradnih produktov. Na podlagi struktur razgradnih produktov smo nato želeli določiti kemizme razgradnje venetoklaksa. Cilj je bil tudi vključitev principa razvoja analizne metode z vgrajeno kakovostjo (AQbD) in s tem izboljšanje robustnosti analizne metode in boljše razumevanje vplivov posameznih parametrov analizne metode na ključne odzive analizne metode. V uvodnem poglavju smo predstavili venetoklaks in njegovo potencialno široko terapevtsko uporabnost v obliki preglednega znanstvenega članka, ki zavzema pregled znanstvene in patentne literature. Poglavje smo dopolnili s teoretičnim ozadjem testiranja stabilnosti ter AQbD. V prvem poglavju raziskovalnega dela je predstavljen razvoj analizne metode reverzno-fazne tekočinske kromatografije za določevanje stabilnosti venetoklaksa z uporabo principov AQbD. Razvoj metode je potekal na stresnih vzorcih venetoklaksa. Celoten proces razvoja analizne metode je bil sestavljen in začetnih poskusov po principu spreminjanja enega faktorja naenkrat (OFAT), definicijo tarčnega profila analizne metode (ATP), izbiro kritičnih atributov metode (CMA), oceno tveganja, identifikacijo kritičnih parametrov metode (CMP), začetnih presejalnih poskusov, optimizacije, testiranja robustnosti, določitve območja delovanja metode (MODR) in postavitve kontrolne strategije. Metodo smo kvalificirali v delovni točki, kjer smo potrdili tarčni profil analizne metode: zmožnost določanja venetoklaksa ob prisotnosti razgradnih produktov v koncentracijskem območju od 80 – 120% tarčne koncentracije s točnostjo 100 ± 2% in ponovljivostjo z ? 2% relativnega standardnega odklona (RSD). Metoda, ki smo jo razvili je ustrezna za določanje venetoklaksa ob prisotnosti glavnih razgradnih produktov pridobljenih s stresnimi testi in jo lahko uporabljamo za določanje stabilnosti venetoklaksa. V drugem poglavju raziskovalnega dela smo opisali izvedbo stresnih testov, izolacijo glavnih razgradnih produktov in določevanje strukture razgradnih produktov. Predpostavili smo glavne kemizme razgradnje venetoklaksa. Identificirali smo štiri glavne razgradne produkte venetoklaksa ob dodatku močne kisline, tri glavne razgradne produkte venetoklaksa ob dodatku močne baze in en razgradni produkt venetoklaksa, ki nastane z oksidacijo. Pri tem smo poleg predvidene hidrolize N-acilsulfonamiden vezi, določili še dekarboksilacijo kislinskega fragmenta, ki nastane iz omenjene hidrolize, dimerizacijo venetoklaksa preko metilenskega mostička ob prisotnosti dimetil sulfoksida, ciklizacijo o-nitroanilinskega dela, substitucijo amina na 2-nitro-substituiranem benzenu s hidroksilno skupino in oksidacijo dušika piperazinskega obroča. Tretje poglavje obsega in silico napovedovanje razgradnih produktov venetoklaksa. Razgradne produkte smo s programskim orodjem napovedovali pri različnih eksperimentalnih pogojih. Primerjali smo rezultate eksperimentalno pridobljenih razgradnih produktov z napovedanimi. Uporabljeno in silico orodje je uspešno napovedalo tri od sedmih eksperimentalno določenih razgradnih produktov venetoklaksa.20212021-04-15 07:15:11Doktorsko delo/naloga126288VisID: 16424sl