Identifikacija in ovrednotenje mimotopov glavnega alergena čebeljega strupa Api m 1 za razvoj specifične imunoterpaijeZahirović, Abida (Avtor) Lunder, Mojca (Mentor) Korošec, Peter (Komentor) specifična imunoterapijaalergeni čebeljega strupaalergijski odzivmimotop Api m 1alergeni ambrozijeanaliza alergenovAlergija po piku ĉebele je nevarno bolezensko stanje, saj lahko povzroĉi hude, v nekaterih primerih ţivljenjsko ogroţajoĉe anafilaktiĉne reakcije, obenem pa je specifiĉna imunoterapija s ĉebeljim strupom dolgotrajna, naporna in povzroĉa neţelene stranske uĉinke, zato obstaja potreba po novih uĉinkovinah in alternativnih strategijah zdravljenja. Eno izmed perspektivnejših skupin novih imunoterapevtikov predstavljajo peptidni mimetiki epitopov alergenov (mimotopi). Po principu molekularne mimikrije so mimotopi sposobni sproţiti zelo podoben ali celo enak imunski odziv, kot epitopi, katere posnemajo. Poslediĉno lahko v imunoterapiji predstavljajo nadomestne ligande za alergene. V primerjavi z alergeni je njihova prednost v tem, da, kot kratki peptidi, nimajo vezavnih mest potrebnih za premreţenje IgE na površini efektorskih celic. Zaradi potencialne terapevtske uporabnosti smo v okviru doktorskega dela poiskali mimotope poglavitnega alergena ĉebeljega strupa, Api m 1. Z rešetanjem bakteriofagnih knjiţnic kratkih nakljuĉnih peptidov na tarĉnih protitelesih IgG, usmerjenih proti Api m 1, smo odkrili kolekcijo 46 edinstvenih peptidov. V testih vrednotenja je 36 peptidov izkazovalo moĉno in specifiĉno vezavo do tarĉnih protiteles ter kompeticijo z Api m 1 za iste paratope (ali vezišĉa v neposredni bliţini). Med peptidi smo odkrili dva izrazita aminokislinska motiva GP[S/N/D]ELG[R/K/H] in D[K/R/H]SKP(H). Vpliv prispevka posameznih aminokislinskih ostankov znotraj motiva za vezavo na tarĉna protitelesa smo ocenili s testom alaninskega rešetanja. Pri linearnem mimotopu GRMGPSELGPVIG sta se glutaminska kislina in lizin izkazali kot kljuĉni za vezavo, medtem ko alaninske razliĉice cikliĉnega mimotopa GCWDSLGRAC niso obdrţale vezavnih lastnosti izvornega peptida. Aminokislinska zaporedja pridobljenih peptidov smo in silico prilegali na Api m 1 in doloĉili epitopa, ki gradita površinsko izpostavljeni zanki znotraj regije 17-24 na N-koncu Api m 1 in znotraj regije 119-124 na C-koncu. Za namen aktivne imunizacije smo na podlagi analize rezultatov našega raziskovalnega dela in podatkov iz literature izbrali majhni plašĉni protein pIII iz bakteriofaga M13 kot samostojni nosilec mimotopov. Štiri predstavnike identificiranih epitopov smo sintetizirali in jih hkrati pripravili kot fuzijske proteine z nosilcem pIII, tako da smo jih izolirali iz periplazme E. coli. Tako pripravljenim konstruktom in sinteznim peptidom smo ovrednotili njihov imunoterapevtski potencial. Ker smo v procesu selekcije kot tarĉna protitelesa uporabili IgG iz zajĉjega seruma, smo preverili ali mimotopi ohranijo sposobnost vezave na protitelesa IgE iz seruma pacientov, alergiĉnih za strup ĉebele. S testom toĉkovnega nanosa (ang. dot blot) smo potrdili, da se IgE iz seruma 12 pacientov, reaktivnih na Api m 1, specifiĉno veţejo na štiri izbrane mimotope, spojene z nosilcem pIII, kar potrjuje, da so identificirani epitopi relevantni za oba izotipa protiteles. S pomoĉjo testa aktivacije bazofilcev (ang. basophil activation test, BAT) smo ugotovili, da mimotopi, spojeni s pIII, ne aktivirajo bazofilcev, torej niso alergogeni. Po stimulaciji s sinteznimi peptidi prav tako nismo zaznali aktivacije bazofilcev, s ĉimer smo izkljuĉili moţnost, da peptidni mimotopi aktivirajo bazofilce preko drugih od IgE neodvisnih mehanizmov. Dodatno smo preverili, ali lahko peptidni mimotopi, z blokado vezavnih mest na IgE, prepreĉijo degranulacijo bazofilcev, ki jo sproţi alergen Api m 1. Preliminarni rezultati kaţejo, da ni razlik med aktivacijo bazofilcev, ki jo je povzroĉi Api m 1, in aktivacijo, ki jo je povzroĉil Api m 1 v prisotnosti mimotopov. Vseeno opisan koncept predstavlja osnovo za nadaljnji razvoj tega novega pristopa k zdravljenju alergij. Vpliv mimotopov na T celiĉni odziv smo ovrednotili z doloĉanjem citokinov v kulturi mononuklearnih celic iz periferne krvi alergiĉnih pacientov. Ĉebelji strup in Api m 1 sta spodbudila preteţno citokine Th2, medtem ko je mimotop, spojen s pIII, poveĉal izloĉanje interferona gama (IFN-γ), kar nakazuje premik citokinskega profila iz Th2 v Th1. Izsledki raziskave tako opredeljujejo mimotope Api m 1 kot obetavne uĉinkovine za nadaljni razvoj hipoalergenih uĉinkovin za varnejšo imunoterapijo alergije po piku ĉebele. V drugem delu doktorske disertacije smo tehnologijo rešetanja bakteriofagnih knjiţnic uporabili za doloĉitev epitopov poglavitnega alergena ambrozije, Amb a 1, pri katerem je dodaten izziv predstavljalo dejstvo, da tridimenzionalna struktura proteina ni znana. Odkrili smo 6 peptidov, ki so specifiĉno vezali tako na tarĉna protitelesa IgG, usmerjena proti Amb a 1 kot tudi na IgE iz zmesi serumov alergiĉnih pacientov. Izselekcionirani peptidi so se le šibko ujemali s primarnim zaporedjem Amb a 1, kar je nakazovalo, da so epitopi konformacijski. Za doloĉitev konformacijskih epitopov smo peptide prilegali na homologni tridimenzionalni model Amb a 1, ki smo ga izdelali v raĉunalniškem programu za molekulsko modeliranje Phyre2. Po prileganju smo z EpiSearch analizo definirali lokacijo moţnih epitopov na površini molekule okoli aminokislinskih ostankov K104, S110, H214 in W312. V zadnjem delu smo se lotili razvoja nove metode za soĉasno analizo veĉ alergenov v testu aktivacije bazofilcev (multipleks BAT) s pomoĉjo fluorescenĉnega oznaĉevanja alergenov z nanokristali Qdot. Poglavitna alergena ĉebeljega strupa, Api m 1 in Api m 2, smo konjugirali z nanokristali Qdot dveh razliĉnih velikosti ter primerjalno ovrednotili njihovo primernost za analizo veĉ alergenov hkrati. Uporabili smo nanokristale karboksil-Qdot, pri katerih vezava na alergen poteka preko karboksilne skupine in amino-Qdot, pri katerih vezava poteka preko aminske skupine. Potrdili smo, da oznaĉevanje alergenov tako z nanokristali karboksil- kot tudi z amino-(PEG)-Qdot ni vplivalo na njihovo IgE reaktivnost. Nasprotno pa se je alergogena aktivnost oz. sposobnost prekriţanja IgE na površju bazofilcev ohranila le pri alergenih, oznaĉenih z nanokristali amino-(PEG)-Qdot. Slednje smo nato uporabili v multipleks testu BAT in rezultat obiĉajne analize BAT primerjali z rezultatom multipleks BAT. Ugotovili smo ujemanje pri 15 od 17 bolnikov in 6 od 6 kontrolnih osebah s primerljivimi krivuljami odziva na alergen, na podlagi ĉesar sklepamo, da so alergeni, oznaĉeni z nanokristali amino-(PEG)-Qdot, uporabni za soĉasno analizo aktivacije bazofilcev z veĉ alergeni. Multipleks BAT je pomembna nadgradnja trenutnega testa, ki bo pocenil in olajšal diagnostiĉno obravnavo dvojno pozitivnih in polisenzibiliziranih bolnikov, obenem pa odpira nove moţnosti za raziskave, kot je na primer preuĉevanje razporeditev površinskih IgE na efektorskih celicah.[A. Zahirović]20202021-03-12 09:29:53Doktorska disertacija125355UDK: 615.37:616-056.43:595.799(043.3)COBISS_ID: 25939715sl