Vpliv genov povezanih z amiotrofično lateralno sklerozo na biokemijske lastnosti in celično lokalizacijo proteina TDP-43Bajc Česnik, Ana (Avtor) Rogelj, Boris (Mentor) ALSTDP-43hnRNPA1MATR3VCPUBQLN2citoplazemska agregacijaUvod: Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je smrtonosna napredujoča nevrodegenerativna bolezen, za katero so značilni citoplazemski skupki proteinov v prizadetih nevronih. Glavna komponenta teh inkluzij je ubikvitiniran, fosforiliran in cepljen protein TDP-43. Primerov ALS z mutacijami v genu je TDP-43 zelo malo, kar pomeni, da ima TDP-43 v patoloških agregatih pri večini pacientov povsem običajno zaporedje. Vedno več raziskav nakazuje, da imajo citoplazemski skupki TDP-43 lastnosti podobne prionskim proteinom. Zanje je značilno sejanje agregatov in njihovo širjenje med celicami in vitro in in vivo, novejše študije pa so identificirale tudi različne tipe agregatov pri bolnikih z ALS in frontotemporalno demenco (FTD). Alternativne patološke konformacije agregatov bi lahko podobno kot sevi prionskih proteinov, bile osnova za raznolikost proteinopatij TDP-43 in heterogenost bolezni. Raziskovalne skupine so poleg TDP-43 identificirale že več kot 50 genov, ki povzročajo ali vplivajo na nastanek ALS in so vključeni v dve skupini celičnih procesov: metabolizem RNA in razgradnja proteinov. Pri tem pa vloga drugih genov, povezanih z ALS in njihovih mutacij na agregacijo TDP-43, ostaja neznanka. Namen dela in hipotezi: V pričujoči študiji smo primerjali vpliv več mutiranih in nemutiranih genov, povezanih z ALS, na agregacijo TDP-43 in biokemijske lastnosti agregatov in vitro. Hipotezi, na katerih sloni raziskava, se osredotočata na dva vidika agregacije proteina TDP-43 - na vpliv genov povezanih z ALS na agregacijo TDP-43 in na citoplazemsko lokalizacijo agregatov TDP-43: Izražanje z ALS povezanih genov (UBQLN2, MATR3, VCP, hnRNPA1) vpliva na biokemijske lastnosti in/ali celično lokalizacijo proteina TDP-43. Modeliranje okvar jedrno-citoplazemskega transporta v celicah zaostri patološke spremembe, ki so posledica izražanja posamezne mutacije povezane z ALS. Metode dela: Da bi raziskali oba vidika nastanka agregatov TDP-43 smo najprej razvili nov in vitro model agregacije TDP-43 v celični liniji SH-SY5Y. Okvare jedrno-citoplazemskega transporta TDP-43 smo modelirali z eliminacijo signala za jedrno lokalizacijo (NLS) in s tem premaknili TDP-43 iz jedra v citoplazmo. Nato smo postopoma skrajševali LCD proteina in s tem zmotili fiziološko konformacijo dimerov TDP-43. Pri ko-transfekcijskih eksperimentih, s katerimi smo želeli preveriti vpliv prej naštetih mutiranih in nemutiranih z ALS-povezanih genov na agregacijo TDP-43, smo uporabili celoten TDP-43 z odstranjenim NLS (dNLS) in TDP-43 brez NLS in IDR2 (dNLSd343). Nastanek agregatov v kotransfeciranih celicah smo kvantificirali s konfokalno mikroskopijo in nadalje analizirali s programom ImageJ z dodanim vtičnikom Shape Descriptors. Topnost oziroma netopnost agregatov v pufrih RIPA in UREA smo analizirali s prenosom western. Rezultati in razprava: Pokazali smo, da krajšanje domene LCD vodi do različnih vzorcev agregacije TDP-43. S ko-transfekcijo konstruktov dNLS in dNLSd343 z mutiranimi in nemutiranimi z ALS-povezanimi geni smo pokazali, da ima vsak izmed testiranih genov edinstven vpliv na vzorec agregacije TDP-43 in na topnost agregatov. Te učinke smo preučevali v kontekstu okvarjenega nukleocitoplazemskega transporta, ki je zaostril patološko agregacijo v celicah ko-transfeciranih z mutiranimi ali nemutiranimi z ALS-povezanimi geni. Nekateri geni, kot sta na primer mutirani in nemutirani hnRNPA1 so zmanjšali število agregatov in povečali njihovo topnost, drugi pa so povečali število agregatov in/ali njihovo velikost in/ali zmanjšali njihovo topnost. Pokazali smo tudi, da vsak izmed genov edinstveno vpliva tako na dNLS kot na dNLSd343, kar kaže na pomembno vlogo skrajnega C-končnega dela domene LCD pri nastanku in maturaciji agregatov. Izsledki naše študije tako potrjujejo, da vsak izmed z ALS-povezanih genov, ki smo jih raziskovali, edinstveno vpliva na procese agregacije TDP-43, kar vodi do nastanka različnih »tipov agregatov,« ki bi lahko predstavljali temelj za heterogenost bolezni ALS. Zaključki in znanstveno-raziskovalni pomen študije: Študija, predstavljena v tej doktorski disertaciji je prva, ki primerja vpliv z ALS-povezanih genov na agregacijo proteina TDP-43. V sklopu študije smo tudi razvili model agregacije proteina TDP-43, s katerim bi lahko v prihodnosti raziskovali zmožnost potencialnih terapevtskih učinkovin za zmanjšanje ali eliminacijo agregatov TDP-43 in s tem izboljšanje patoloških sprememb v prizadetih celicah bolnikov z ALS. Naši rezultati potrjujejo potrebo po primerjalnih raziskavah na področju ALS in razkrivajo, kako različni mehanizmi interagirajo na molekulskem nivoju in vodijo v nevrodegeneracijo, kar se bo morda izkazalo kot ključnega pomena za uspešen razvoj terapevtikov.20202020-12-03 12:12:21Doktorsko delo/naloga122360VisID: 16291COBISS_ID: 42158083sl