Proučevanje medmolekulskih interakcij med fosfolipidnim dvoslojem na trdnem nosilcu, aneksinom A5, β2-glikoproteinom I in protitelesi proti β2-glikoproteinu I z mikroskopom na atomsko siloKobold, Andrej (Avtor) Božič, Borut (Mentor) Čučnik, Saša (Komentor) antifosfolipidna protitelesaaneksin A5β2-glikoprotein Ilipidni dvosloj na trdnem nosilcumikroskop na atomsko siloLipidni dvosloj na trdnem nosilcu v kombinaciji z mikroskopom na atomsko silo omogoča in vitro študije (pato)fizioloških procesov na celični membrani pod fiziološkimi pogoji. Antifosfolipidni sindrom je primer stanja, kjer avtoprotitelesa proti različnim proteinom, udeleženih v hemostazi, spremenijo procese na aktivirani celični membrani, kar vodi v ponavljajoče tromboze in zaplete v nosečnosti. V našem delu smo v tekočinski celici mikroskopa na atomsko silo pri fizioloških pogojih proučevali vpliv izoliranih antifosfolipidnih protiteles in β2-glikoproteina I na celovitost antikoagulacijske kristalne mreže aneksina A5 na fosfolipidnem dvosloju. Specifična protitelesa proti protrombinu in β2-glikoproteinu smo izolirali iz pacienta s primarnim antifosfolipidnim sindromom z metodami afinitetne kromatografije, čistost in specifičnost pa potrdili z encimskoimunokemijskimi metodami. Fosfolipidne vezikle smo pripravili z odparevanjem topila in tvorbo filma, ki smo ga hidrirali in ultrazvočno obdelali. Vezikli so pri inkubaciji na sljudi tvorili fosfolipidni dvosloj. Z mikroskopom na atomsko silo smo v kontaktnem načinu slikali površino dvosloja in opazovali spremembe po injiciranju aneksina A5, β2-glikoproteina I in protiteles proti β2-glikoproteinu I. Po analizi izoliranih specifičnih protiteles se nam poraja vprašanje o obstoju podpopulacije protiteles, ki prepoznavajo tako protrombin kot β2-glikoprotein I oziroma morebitne skupne epitope. Ugotovili smo, da je velikost veziklov odvisna predvsem od moči ultrazvočne obdelave, manj pa od časa obdelave. Največji delež pokritosti sljude z dvoslojem smo dosegli z vezikli velikosti 100–200 nm. Pokazali smo, da je hitrost kristalizacije in kristalna oblika aneksina A5 odvisna od koncentracije aneksina A5 in deleža fosfatidilserina. Vezave β2-glikoproteina I na dvosloj nismo zaznali niti v prisotnosti protiteles. Prisotnost imunskega kompleksa ni vplivala na kristalizacijo aneksina A5. Nevezava β2-glikoproteina I je lahko posledica eksperimentalnih pogojev ali njegovega izvora. Uporabljeni model ima vlogo v diagnostiki antifosfolipidnega sindroma z vrednotenjem različnih antifosfolipidnih protiteles. Služi lahko tudi za iskanje novih učinkovin za zdravljenje antifosfolipidnega sindroma.20202020-11-07 08:45:11Magistrsko delo/naloga121912VisID: 78115sl