Determinante aktivacije in temperaturne stabilnosti pernizina, serinske proteinaze iz hipertermofilne arheje Aeropyrum pernix K1Bahun, Miha (Avtor) Poklar Ulrih, Nataša (Mentor) subtilizinAeropyrum pernixpernizinproregijaaktivacijatermostabilnostEncimi, ki izvirajo iz termofilnih organizmov, so zaradi izjemne stabilnosti zaželeni za uporabo v industriji. Eden izmed industrijsko zanimivih encimov je pernizin iz hipertermofilne arheje Aeropyrum pernix. Pernizin je subtilizinu podobna zunajcelična proteinaza, ki izmed ostalih proteinaz izstopa zaradi zmožnosti razgradnje infektivnih prionskih proteinov. Pernizin bi torej bilo možno uporabiti kot sredstvo za čiščenje površin, okuženih s prioni, uporaben pa bi bil tudi v živilski ter usnjarski industriji. Pernizin je tako kot ostali subtilizini po sintezi sprva v neaktivni proobliki, ki se nato avtokatalitično pretvori v aktivno proteinazo. V sklopu doktorskega dela smo proučili proces aktivacije propernizina, pri čemer smo pripravili različne mutante tega proteina in preverili njihovo zmožnost zvitja ter aktivacije. Ugotovili smo, da aktivacija propernizina obsega več stopenj. Sprva se cepi peptidna vez med proregijo in katalitično domeno, kar vodi do nastanka avtoprocesiranega kompleksa. Ta zaradi inhibitornega delovanja nekovalentno vezane proregije še ni proteolitično aktiven. Aktivacija se zaključi z disociacijo avtoprocesiranega kompleksa ter razgradnjo sproščene proregije s katalitično domeno. Za ta končni korak aktivacije so potrebni kalcijevi ioni, ki omogočijo zvitje pernizina v urejeno konformacijo in ga s tem zaščitijo pred avtolizo. Izkazalo se je, da ima ključno vlogo pri stabilizaciji pernizina med aktivacijo edinstvena insercija, ki tvori dodatno mesto za vezavo kalcijevega iona na katalitični domeni. Poleg kalcija so za aktivacijo propernizina potrebne tudi temperature nad 80 °C. Namreč, sproščeno proregijo destabilizirajo zgolj visoke temperature, kar vodi v njeno razgradnjo in zaključek aktivacije. Ugotovili smo, da je glavna vloga proregije pernizina pri aktivaciji inhibicija katalitične domene, saj proregija ni vplivala tudi na zvitje te domene, kot je to sicer primer pri bakterijskih subtilizinih. Optimizirali smo tudi način pridobivanja rekombinantnega pernizina v bakterijah Escherichia coli. Agregacijo propernizina v citoplazmi E. coli smo preprečili z usmeritvijo sintetiziranega propernizina v periplazemski prostor celic, s čimer smo hkrati tudi poenostavili postopek čiščenja te proteinaze. Pernizin, izoliran iz periplazme, je ohranil visoko temperaturno stabilnost ter aktivnost. Pripravili smo tudi več različic pernizina, skrajšanih z N-konca oziroma C-konca, ter preverili njihovo aktivnost. Rezultati kažejo, da so za visoko temperaturno stabilnost pernizina pomembna tudi zunanja področja katalitične domene, v katerih so vezavna mesta za kalcijeve ione.20202020-10-25 07:15:03Doktorsko delo/naloga121735VisID: 14097COBISS_ID: 37466627sl