Razvoj encimskoimunskega testa na osnovi nanotelesa SdAb19 za določitev koncentracije virusnega proteina Nef v plazmiMavec, Nina (Avtor) Lenassi, Metka (Mentor) Turk, Dušan (Komentor) Nefencimskoimunski testnanoteloSdAb19izražanjePosamezniki z virusom HIV-1, ki se zdravijo s terapijo ART in imajo v krvi nezaznavno virusno obremenitev, vseeno nimajo povsem povrnjene imunske funkcije. Imajo tudi znatno večje tveganje za razvoj bolezni, povezanih z vnetjem, kot so rak, kardiovaskularne in nevrokognitivne bolezni. K pojavu omenjenih bolezni najverjetneje prispevajo tudi telesni rezervoarji virusa HIV-1, ki lahko proizvajajo nekatere virusne proteine in transkripte, kljub odsotnosti proizvodnje infektivnih virionov. Znano je, da se protein Nef virusa HIV-1 izloča iz okuženih celic z zunajceličnimi vezikli in da je prisoten v krvni plazmi polovice aviremičnih posameznikov, zato je dober kandidatni označevalec za ovrednotenje aktivnih telesnih rezervoarjev virusa HIV-1. Trenutno obstaja le en komercialni encimskoimunski test za detekcijo proteina Nef, ki pa ima številne pomanjkljivosti. Z uporabo nanotelesa SdAb19, ki ima široko specifičnost za protein Nef različnih sevov virusa HIV-1, hkrati pa protein veže z nanomolarno afiniteto, bi rešili nekatere od teh pomanjkljivosti. Hipoteza magistrskega dela je, da bomo z izražanjem heksahistidinsko označenih nanoteles v E. coli in čiščenjem izraženih nanoteles z nikljevo afinitetno kromatografijo in kromatografijo z ločevanjem po velikosti pridobili zadostne količine nanotelesa SdAb19 za uporabo v encimskoimunskem testu za detekcijo virusnega proteina Nef. Za kasnejšo biotinilacijo in imobilizacijo nanotelesa SdAb19 na podlago pri encimskoimunskem testu smo izrazili tudi bakterijsko biotin ligazo BirA, označeno s proteinom, ki veže maltozo. Z optimizacijo pogojev izražanja smo določili najuspešnejše pogoje za izražanje nanoteles v bakterijah. Uspešno je bilo izražanje v citoplazmi celic E. coli BL21[DE3], za pridobivanje nanoteles v topni obliki pa je bilo pomembno, da je izražanje potekalo počasi, kar smo dosegli z gojenjem kultur pri nizki temperaturi, s stresanjem pri nizkih vrtljajih ter z uporabo laktoze kot induktorja. V bakterijah smo uspešno izrazili nanotelesa SdAb19 in SdAb19-AviTag in jih očistili z nikljevo afinitetno kromatografijo in kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Pri enakih pogojih smo izrazili in očistili tudi bakterijsko biotin ligazo BirA-MBP. V nadaljevanju bomo nanotelesa modificirali, da jih bomo lahko uporabili za lovljenje ali detekcijo proteina Nef v encimskoimunskem testu.20202020-10-19 16:20:06Magistrsko delo/naloga121601VisID: 6613COBISS_ID: 38566915sl