Analiza delovanja inhibitorja kinaze Hog1 na aktivnost HwHog1 pri glivi Hortaea werneckiiKejžar, Anja (Avtor) Kos, Janko (Mentor) Lenassi, Metka (Komentor) Hortaea werneckii Hog1 inhibitorji Hog1 MAP kinaza signalna pot HogKljub številnim raziskavam odziva na povišano okoljsko osmolarnost pri ekstremno halotolerantni črni kvasovki Hortaea werneckii, ostaja vprašanje ključne in nenadomestljive vloge MAP kinaze HwHog1 v odgovoru nerešeno. Aktivacija HwHog1 je uravnavana s signalno potjo HOG, ki preko senzorjev v membrani prenese signal na MAP kinazno kaskado, ki sproţi fosforilacijo HwHog1, ta pa nadalje uravnava izraţanje tarčnih genov in delovanje določenih proteinov. Pri reševanju tega problema smo se odločili za kemijsko-genetski pristop, pri čemer ţelimo za inhibicijo aktivnosti HwHog1 uporabiti prvi znan inhibitor aktivnosti nativnega Hog1, homologa proteina HwHog1 pri Saccharomyces cerevisiae. V ta namen smo najprej pripravili kvasni vektor z vstavljenim brezintronskim genom HwHOG1, ga s transformacijo prenesli v sev S. cerevisiae z mutiranim lastnim genom HOG1 in z analizo odtisa western nakazali na prisotnost proteina HwHog1 v celicah S. cerevisiae, transformiranih z omenjenim plazmidom. Pripravljen sistem je omogočil preizkus delovanja inhibitorja na HwHog1 v enakem genetskem ozadju, kot je bilo uporabljeno za testiranje delovanja inhibitorja na Hog1. S testi funkcionalne komplementacije ter detekcijo s protitelesi proti fosfo(p38) smo pokazali, da HwHog1 uspešno komplementira funkcijo MAP kinaze Hog1 v celicah S. cerevisiae, torej lahko sprejme signal od MAPK kinaze Pbs2, se translocira v jedro in tam regulira izraţanje genov, kar omogoči prilagoditev S. cerevisiae na povišano osmolarnost v okolju. Z inhibitorskimi testi na ploščah smo pokazali, da inhibitor PD447, ki dokazano deluje na MAP kinazo Hog1 v S. cerevisiae, učinkovito inhibira tudi HwHog1, homologni protein iz H. werneckii, kadar je ta izraţen v S. cerevisiae. Inhibitor je posledično primeren za nadaljnjo uporabo pri kemijsko-genetskih študijah HOG poti pri H. werneckii. V prihodnjih raziskavah ţelimo preveriti, ali inhibitor PD447 učinkovito deluje tudi na aktivnost HwHog1, kadar se ta izraţa v črni kvasovki H. werneckii in tako prvič pokazati edinstvenost vloge HOG poti in HwHog1 v odzivu na povišano osmolarnost v okolju pri črni kvasovki H. werneckii.[A. Kejžar]20112020-09-30 12:35:44Diplomsko delo121159UDK: 542:577COBISS_ID: 3082097sl