Priprava referenčnega materiala za genotipizacijo polimorfizma (TA)n ponovitev v genu UGT1A1 z uporabo molekularnega kloniranjaŠavli, Jerneja (Avtor) Ostanek, Barbara (Mentor) Mlakar, Vid (Komentor) gen UGT1A1genetske preiskaveGilbertov sindromdiagnostikareferenčni materialGilbertov sindrom je najpogostejša dedna motnja v presnovi bilirubina, ki je posledica sprememb nukleotidnega zaporedja v genu za uridindifosfat-glukuronil-transferazo 1A1 (UGT1A1). Največkrat gre za spremembo znotraj nekodirajoče promotorske regije eksona 1A1 v zaporedju A(TA)6TAA. V zaporedje se vrineta eden ali dva dodatna para TA. Gre za benigno motnjo, ki sama po sebi ne zahteva posebnega zdravljenja. Diagnostika Gilbertovega sindroma je kljub temu zelo pomembna, saj so ti bolniki veliko bolj dovzetni za stranske učinke nekaterih zdravilnih učinkovin kot je irinotekan. Na žalost ni javno dostopnih referenčnih materialov, ki bi nam bili v pomoč pri določanju ponovitev (TA)n in bi imeli certifikat o ustreznosti ter s sekvenciranjem določeno nukleotidno zaporedje. Cilj diplomske naloge je bil pripraviti referenčni material, ki bo nepogrešljiv del molekularne analize polimorfizma ponovitev (TA)n in ga bomo lahko s pomočjo bakterij pomnožili v poljubno velikih količinah, si tako zagotovili njegove neomejene zaloge, ter ga uporabili tudi za nadaljnje proučevanje in izdelavo še hitrejših in učinkovitejših metod za določanje dolžin mikrosatelitov kot so ponovitve (TA)n. V prvi stopnji smo optimizirali pogoje verižne reakcije s polimerazo in pomnožili odsek gena UGT1A1, v katerem se nahaja tandemska ponovitev (TA)n. Pomnoženi odsek smo izolirali iz agaroznega gela, cepili z restrikcijskimi endonukleazami in vgradili v plazmidni vektor. Plazmidni konstrukt smo transformirali v kompetentne bakterijske celice in jih nanesli na selekcijsko gojišče. Iz naključnih bakterijskih kolonij smo izolirali plazmidno DNA. Nato smo pomnožili odsek plazmidne DNA, ki je vseboval polimorfizem in s fragmentno analizo določili velikost in na podlagi tega število ponovitev (TA)n v plazmidu. Po enemu plazmidu z vsako ponovitvijo (TA)n smo določili nukleotidno zaporedje in tako dodatno preverili njihovo ustreznost za uporabo kot referenčni material. Izdelati nam je uspelo plazmide s 4, 5, 6, 7 in 8 ponovitvami (TA)n, ki jih lahko sestavimo v katerekoli heterozigotne ali homozigotne genotipe. Referenčni material nam bo služil kot interni standard, ki bo omogočil oceno pravilnega poteka analize, hkrati pa bomo z njegovo pomočjo lažje interpretirali rezultate analize vzorca z neznanimi ponovitvami (TA)n. Izdelani konstrukti bodo služili tudi kot pripomoček za izdelavo novih analiznih postopkov za genotipizacijo, občutljivih tudi za redke ponovitve (TA)n, ki jih do sedaj nismo imeli v zadostnih količinah za optimizacijo ostalih možnih genotipizacijskih metod.[J. Šavli]20122020-09-30 10:58:54Diplomsko delo121147UDK: 577.2+616-074(043.2)COBISS_ID: 3225969sl