Uporaba haloalkan dehalogenazne domene za označevanje proteina MLKLFratina, Luka (Avtor) Gunčar, Gregor (Mentor) konfokalna fluorescenčna mikroskopijamodificirana dehalogenazaMLKLkloniranje IVAKonfokalna fluorescenčna mikroskopija omogoča opazovanje določenega proteina v celicah z uporabo fluorescenčnih označevalcev za proteine. Najpogosteje se uporablja zeleni fluorescenčni protein, ki fluorescira v zelenem spektru. A odkriva se še več novih označevalcev in eden od teh je modificirana haloalkan dehalogenaza iz bakterije Rhodococcus rhodochrous. V aktivnem mestu modificrane haloalkan dehalogenaze je zamenjan en aminokislinski ostanek, kar omogoča vezavo fluorescenčnega liganda v aktivno mesto. Za opazovanje proteina MLKL v celicah, smo zapis modificirane domene haloalkan dehalogenaze sklopili z zapisom za protein MLKL. MLKL smo uporabili, ker je v aktivni obliki v celični membrani, kar omogoča preverjanje uporabnosti modificirane dehalogenaze za konfokalno fluorescenčno mikroskopijo. Osredotočili smo se na pripravo plazmida, ki vsebuje zapis za MLKL in modificirano domeno dehalogenaze. Za to smo uporabili novo metodo kloniranja IVA. Rezultate smo preverili z agarozno gelsko elektroforezo in z določitvijo nukleotidnega zaporedja ter s tem potrdili, da smo ustvarili plazmid, ki vključuje zapis za oba proteina, ki sta sklopljena in pripravljena za izražanje v celicah in fluorescenčno mikroskopiranje.20202020-09-11 09:45:00Diplomsko delo/naloga119795VisID: 6306COBISS_ID: 32379651sl