Izbor protiteles za kvantitativno določitev kanabinoidnih receptorjev v celičnih linijah raka dojkeLevačić, Patrik (Avtor) Debeljak, Nataša (Mentor) rak dojkeendogeni kanabinoidni sistemcelična linija raka dojkeprotitelesatočkovni nanosEndogeni kanabinoidni sistem (ECS) kontrolira številna fiziološka in patološka stanja. Sestavljata ga kanabinoidni receptor tipa 1 (CB1) ter tipa 2 (CB2), njuni endogeni ligandi (endokanabinoidi) ter proteini, ki regulirajo biosintezo in degradacijo endokanabinoidov. CB1 je visoko izražen v možganskem tkivu, CB2 je izražen izključno v celicah imunskega sistema. Z G proteini sklopljen receptor 55 (GPR55), je kanabinoidni receptor, kateri je glede na aminokislinsko zaporedje, manj kot 15 % podoben CB1 in CB2. Ima sposobnost vezave raznolikih endogenih ter eksogenih kanabinoidnih ligandov, zato je GPR55 glavni kandidat za kategorizacijo kot kanabinoidni receptor tipa 3. Izraža se v možganskem tkivu, endotelijskih celicah ter prebavnem traktu. V sklopu diplomskega dela smo želeli z uporabo metode točkovnega nanosa določiti ustrezne delovne koncentracije primarnih in sekundarnih protiteles proti CB1, CB2 in GPR55. Poleg tega smo za nadaljnjo kvantitativno določitev CB želeli določiti ustreznost protiteles dveh proizvajalcev, Santa Cruz Biotechnology in Abcam, in izbrali protitelesa tistega proizvajalca, s katerimi smo dobili boljše rezultate pri zaznavi. V ta namen smo iz izbrane celične linije pripravili celične lizate in topni frakciji celičnega lizata izmerili koncentracijo proteinov s kompletom standardov govejega serumskega albumina (BSA). Vzorce, nanešene na membrano za imunodetekcijo, smo inkubirali z izbranimi protitelesi in nato slikali s kamero LAS 4000, ki ima sposobnost zajemanja kemiluminiscenčne svetlobe. Naši rezultati nakazujejo, da so protitelesa proti CB1 in CB2 obeh proizvajalcev ustrezna. Odločili smo se, da so protitelesa proizvajalca Santa Cruz Biotechnology ustreznejša za imunodetekcijo CB1 in CB2 v primerjavi s protitelesi proizvajalca Abcam, in so kot taka primerna za nadaljnjo uporabo pri kvantitativnem določanju CB z metodo prenosa Western. Za izbrana protitelesa smo se odločili, ker je jakost signalov bolj zvezna in bolje posname gradient redčitev oz. koncentracij. Raziskave o izražanju GPR55 v celičnih linijah raka dojke so redke Na podlagi rezultatov našega dela smo potrdili izražanje GPR55 v nesmrtni celični liniji raka dojke T-47D.20202020-09-10 17:20:00Diplomsko delo/naloga119700VisID: 6045COBISS_ID: 32541699sl