Karakterizacija interakcije katepsina B s heparinom z mestno-specifično mutagenezoLebar, Blaž (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) katepsin Bheparinalosterična regulacijainhibitorKatepsin B pripada družini papainu podobnih cisteinskih proteaz. Sodeluje pri vrsti celičnih procesov, kjer je odgovoren za cepitev proteinov. Posebna zaporna zanka mu omogoča tako endo- kot eksopeptidazno aktivnost. Pretežno se nahaja v lizosomu. Mnoge študije so ga identificirale kot pomembnega pri različnih patoloških stanjih, med drugim tudi pri artritisu, Alzheimerjevi bolezni in raku. Pri slednjem odigra pomembno vlogo pri migraciji tumorskih celic s cepitvijo komponent zunajceličnega matriksa. Zaradi tega se je pojavila potreba po raziskovanju inhibitorjev tega encima. Eno izmed obetavnih področij je alosterična regulacija, kjer se molekule vežejo v mesto oddaljeno od aktivnega mesta. S tem sprožijo konformacijsko spremembo v encimu, ki privede do njegove spremenjene aktivnosti. Znano je, da je heparin alosterični inhibitor katepsina B. Njegovo vezavno mesto je bilo računalniško umeščeno na območja s presežkom pozitivnega naboja na površini, kar se sklada s pretežno negativnim nabojem na heparinu. V sklopu naše naloge smo nadaljevali raziskave na področju identifikacije vezavnega mesta za heparin. Pripravili smo kombinacije treh mutantov, ki so bile v dosedanjih študijah najbolj obetavne: R85A, K130A in K141A. S tremi dvojnimi ter enim trojnim mutantom smo izvedli kinetične meritve v prisotnosti heparina in določili vrednosti ravnotežne konstante disociacije KD ter jih primerjali z divjim tipom. Pokazali smo, da so ta mesta sicer odgovorna za vezavo heparina, vendar niso edina. Heparin se je še vedno vezal, afiniteta se je znižala v podobnem redu velikosti kot pri enojnih mutantih. Vezavnega mesta nismo uspeli nedvoumno pokazati. Prav tako smo poskušali identificirati male organske molekule, ki bi lahko na divji tip katepsina B delovale podobno kot heparin. Izmed vseh preiskanih smo identificarali le eno: kavno kislino. Vezavo smo okarakterizirali – gre za linearni akompetitivni inhibitor z vrednostjo K_iu približno 110 µM.20202020-09-10 16:25:21Magistrsko delo/naloga119693VisID: 6583COBISS_ID: 31305731sl