Kloniranje skrajšane različice zapisa za dihidroorotat dehidrogenazo iz organizma Plasmodium falciparum in in silico študija inhibicije proteina z izbranimi inhibitorjiMedved, Tadej (Avtor) Klemenčič, Marina (Mentor) dihidroorotat dehidrogenazaPlasmodium falciparumpirazolidinoniumestitevMalarija trenutno še vedno spada med najbolj zaskrbljujoče nalezljive bolezni po svetu. Vsako leto terja več kot 400.000 smrtnih žrtev, blažji primeri bolezni pa negativno vplivajo tudi na prebivalstvo najbolj prizadetih držav. Hudo obliko malarije povzroča protozoj Plasmodium falciparum, katerega določeni sevi so v zadnjih letih razvili odpornost proti uveljavljenim protimalarijskim zdravilom. Posledično je razvoj novih, vrstno specifičnih zdravil postal zelo aktualen. Ena bolj obetavnih tarč za inhibicijo je biosintezna pot pirimidinskih nukleotidov, v kateri hitrost omejujočo reakcijo izvaja dihidroorotat dehidrogenaza. Do sedaj so raziskovalci že razvili več skupin organskih molekul, ki ta encim inhibirajo, in določili njihovo kristalno strukturo v kompleksu s tem encimom. Ena od teh je skupina bicikličnih pirazolidinonov, katerih kristalna struktura pa še ni bila razrešena. V tem diplomskem delu smo želeli pripraviti konstrukt z zapisom za rekombinantno dihidroorotat dehidrogenazo Plasmodium falciparum, uporaben za ekspresijo tega proteina in za določanje njegove kristalne strukture v kompleksu s tremi najmočnejšimi pirazolidinonskimi inhibitorji. Nato smo hoteli z in silico simulacijami sklepati na način vezave. Pripravili smo konstrukt z zapisom za rekombinanten encim z delecijo strukturno neurejene zanke, ki ne vpliva na vezavo inhibitorjev, a encimu preprečuje tvorbo kristalov. Delecijo smo uspešno opravili z mutagenezo z delno prekrivajočima oligonukleotidoma, nastali konstrukt pa je tudi pripravljen za vključitev v ekspresijski vektor z ligacijo lepljivih koncev. Simulacijo vezave oziroma umestitev 3D-struktur inhibitorjev smo opravili s programom AutoDock Vina. Umestitev je bila zastavljena z delno fleksibilnostjo vezavnega mesta, zaradi česar smo dobili bolj informativne rezultate kot prejšnja umestitvena študija. Ti rezultati so tudi bolj v skladu z obstoječimi kinetičnimi podatki. Rezultati simulacije nakazujejo, da se ti pirazolidinoni opirajo predvsem na hidrofobne interakcije z ostanki vezavnega mesta in se ne vežejo tako globoko kot druge skupine inhibitorjev, poleg tega pa tudi ne nastanejo klasične vodikove vezi. Vezavo naj bi tudi olajšale interakcije π-elektronskega oblaka fenilne skupine z različnimi stranskimi verigami, odvisno od položaja te skupine na pirazolidinonskem obroču.20202020-09-09 13:25:00Diplomsko delo/naloga119526VisID: 8721COBISS_ID: 28392707sl