Odkrivanje interakcijskih partnerjev proteina ORF1p iz človeškega retrotranspozona LINE1Habič, Anamarija (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) retrotranspozon LINE1ORF1pinterakcijski partnerjiBARBioIDRetrotranspozon LINE1 je edini še aktivni avtonomni retrotranspozon v genomu človeka, kjer njegove kopije predstavljajo kar 17 % celotne DNA. Aktivnost LINE1 je vzrok za preko 120 monogenskih bolezni, povečana pa je tudi pri nekaterih kompleksnejših boleznih, npr. pri raku. Kljub temu proces retrotranspozicije še vedno ni popolnoma pojasnjen, slabo poznane pa so tudi vloge proteinov, ki so kodirani v zaporedju LINE1. Zlasti nejasne so vloge RNA-vezavnega proteina ORF1p, ki se tipično nahaja v citoplazemskih granulah in kolokalizira z mRNA LINE1. V okviru magistrskega dela smo se osredotočili na proteinsko sestavo granul ORF1p. Z imunocitokemijo smo jih preučevali v celični liniji 2102Ep, v kateri se protein izraža endogeno, ter v več različnih celičnih linijah po prehodni transfekciji. Preverjali smo, ali v normalnih pogojih oz. v prisotnosti stresa kolokalizirajo z označevalnimi proteini telesc P ali stresnih granul. Granule endogenega ORF1p v celicah 2102Ep v normalnih pogojih niso sovpadale z nobenim od preučevanih označevalnih proteinov, kar nakazuje, da izražanje ORF1p v celicah verjetno ne povzroča kroničnega stresa. V nasprotju s tem je ORF1p v določenem deležu z ORF1p prehodno transficiranih celic kolokaliziral s telesci P, v nekaterih pa tudi s stresnimi granulami. To je lahko posledica prekomernega izražanja ORF1p, morda pa kaže tudi fiziološko dinamičnost granul ORF1p. Nedvoumno smo potrdili, da različni akutni eksogeni stresorji (NaAsO2, DTT, NaCl) povzročijo mobilizacijo endogenega in tudi prehodno izraženega ORF1p v stresne granule. V nadaljevanju smo želeli sestavo granul ORF1p v pogojih in vivo podrobneje okarakterizirati še s proteomskima metodama BAR in BioID, ki temeljita na označevanju proteinov v neposredni bližini tarčnega z biotinom. Z njima smo želeli primerjati sestavo granul v nestresiranih in stresiranih celicah ter interaktoma funkcionalnega ORF1p in njegove neaktivne mutirane različice JM111. Za izvedbo BioID smo pripravili več različnih fuzijskih proteinov ORF1p oz. JM111 z biotin ligazo BioID2 oz. TurboID in jih izrazili v sesalskih celicah. Analizirali smo njihovo aktivnost in celično lokalizacijo in na podlagi dobljenih rezultatov izbrali najustreznejše konstrukte za nadaljnje delo. Biotinilirane interakcijske partnerje ORF1p smo iz celičnih lizatov uspešno izolirali s testom »pull down«. Pripravili smo vzorce in kontrole za identifikacijo interakcijskih partnerjev proteina ORF1p s tehniko tekočinske kromatografije sklopljene z masno spektrometrijo. Rezultati bodo osnova za nadaljnje preučevanje funkcij ORF1p, prispevali pa bodo tudi k boljšemu razumevanju kompleksnega procesa retrotranspozicije.20202020-09-08 11:35:15Magistrsko delo/naloga119396VisID: 6529COBISS_ID: 29358339sl