Optimizacija priprave zunajceličnega dela disintegrinske metaloproteaze TACE in analiza cepitve proteina EpCAM in vitroVan Midden, Katarina Petra (Avtor) Lenarčič, Brigita (Mentor) TACEEpCAMregulirana intramembranska proteolizaizražanje in čiščenje proteinovDisintegrinska metaloproteaza TACE (znana tudi pod imenom ADAM17) je pomemben regulator različnih signalnih poti, povezanih z razvojem, imunostjo, vnetjem in nastankom tumorjev. Cepi več kot 90 substratov, ki obsegajo citokine, rastne faktorje in adhezijske molekule. Kljub mnogim raziskavam molekularni mehanizmi cepitve nekaterih substratov še vedno niso pojasnjeni. Eden izmed takih substratov je tudi dimerni transmembranski glikoprotein EpCAM, ki se pogosto povišano izraža pri karcinomih in je zato pomemben diagnostični marker in tarča za protirakave terapije. Cepitev s TACE je prvi korak v signalni poti, ki se prične z regulirano intramembransko proteolizo in v končni fazi sproži prepisovanje onkogenov. S celičnimi študijami in analizo z masno spektrometrijo je bilo pokazano, da se cepitveni mesti nahajata v žlebu med obema podenotama dimera in sta zato proteazi TACE težko dostopni. Mehanizem cepitve proteina EpCAM s TACE tako še ni pojasnjen. Da bi odkrili, ali dimerizacija EpCAM ovira cepitev s TACE in ali so za prepoznavo substrata in cepitev potrebni še kakšni drugi faktorji, smo pripravili različne konstrukte celotnega proteina in zunajcelične domene TACE ter jih izrazili v insektni celični liniji Sf9. Optimizirali smo izražanje in čiščenje topne ektodomene TACE (TACE-EX), ter pripravljen konstrukt uporabili za prvo analizo cepitve različnih oblik ektodomen proteina EpCAM in vitro. S cepitvami smo uspeli pokazati, da lahko TACE prepozna in cepi EpCAM na predvidenih mestih, ter da dimerizacija proteina EpCAM ovira cepitev s TACE. To je tudi prva eksperimentalna potrditev hipoteze, da se mora za cepitev EpCAM nahajati v monomerni obliki.20202020-08-25 13:05:00Magistrsko delo/naloga118175VisID: 11526COBISS_ID: 26524931sl