Primerjava izražanja označevalcev diferenciranih in nediferenciranih mezenhimskih matičnih/stromalnih celic, izoliranih iz različnih delov sinovije kolkaSluga, Nastja (Avtor) Zupan, Janja (Mentor) Stražar, Klemen (Komentor) Mezenhimske matične/stromalne celicemetoda qPCRadipogeni označevalciosteogeni označevalciimunofenotip humanih skeletnih matičnih celic.Mezenhimske matične/stromalne celice (MSC) so redka, neraziskana in izjemno raznolika skupina postnatalnih celic, iz katerih se razvije mišično-skeletni sistem. Nahajajo se v številnih tkivih, pri čemer se med seboj razlikujejo po diferenciacijskemu potencialu, morfologiji, velikosti in izražanju posameznih označevalcev. Imajo imunosupresivne lastnosti in veliko sposobnost regeneracije tkiv ter velik potencial za zdravljenje številnih avtoimunskih, vnetnih in degenerativnih bolezni ter poškodb tkiv. Kljub velikemu potencialu za njihovo uporabo v klinični praksi, še zmeraj veliko težavo predstavlja ohlapna definicija in pomanjkanje specifičnih označevalcev za identifikacijo MSC. Te problematike smo se v naši raziskavi dotaknili tudi mi. Namen raziskave je bil ugotoviti razlike v izražanju genov za označevalce diferenciranih in nediferenciranih MSC iz treh različnih delov sinovije kolka in trabekularne kosti ob kolku. Meritve smo izvedli na 113 vzorcih MSC, 11 različnih pacientov. Tkivni vzorci so bili pridobljeni med rutinsko artroskopijo kolka na Ortopedski kliniki Univerzitetnega kliničnega centra v Ljubljani. Med posegom so bili odvzeti vzorci sinovije na treh predelih kolka ter vzorec trabekularne kosti. Iz tkivnih vzorcev so izolirali primarne MSC, ki so jih v pogojih in vitro izpostavili adipogenemu in osteogenemu diferenciacijskemu mediju.Vzporedno so bili vzorci izpostavljeni tudi bazalnemu gojitvenemu mediju. Ti so nam služili kot kontrola. Po gojenju so iz celic izolirali RNA in jo v procesu reverzne transkripcije prepisali v komplementarno DNA. Ta vzorec smo uporabili za določanje izražanja genov za tri adipogene označevalce ADIPOQ, PPARG in FABP4 ter štiri osteogene označevalce OC, ALP, COL1A1 in RUNX2. Magistrska naloga pa vključuje tudi določitev izražanja štirih novih označevalcev MSC, katerih metodo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo v realnem času (qPCR), smo predhodno zoptimizirali. To so označevalci, ki jih kodirajo geni PDPN, CD73, CD146 in CD16 ter predstavljajo imunofenotip humanih skeletnih matičnih celic. Izražanje genov za označevalce smo merili z metodo qPCR. Preizkusili smo tri hipoteze, ki predpostavljajo, da je izražanje genov za adipogene, osteogene in nove označevalce v MSC, glede na mesto odvzema tkiv v kolku, za izolacijo teh celic enako. Pri adipogenih in osteogenih označevalcih, smo preverjali tudi razlike v njihovem izražanju med diferenciranimi MSC in njihovimi kontrolami, da bi ugotovili, če nam ti geni služijo kot učinkoviti označevalci adipo- in osteo-geneze. Pri vseh genih za adipogene označevalce lahko potrdimo uspešno adipogeno diferenciacijo, saj so se bolje izražali pri vzorcih MSC, ki so bili izpostavljeni adipogenemu gojitvenemu mediju kot pri njihovih kontrolah. Prvo hipotezo smo sprejeli, saj statistično značilne razlike v izražanju genov adipogenih označevalcev, glede na mesto odvzema tkiv, nismo uspeli dokazati. Drugo hipotezo delno sprejeli, saj smo dokazali statistično značilno razliko v izražanju osteogenih genov glede na mesto odvzema samo za dva gena, OC in COL1A1. Uspešno osteogeno diferenciacijo lahko potrdimo pri COL1A1, zato smo izražanje tega gena predlagali za označevalca osteogene subpopulacije MSC, izoliranih iz trabekularne kosti ob kolku. Ugotovili smo, da je izražanje genov za nove označevalce glede na mesto odvzema tkiv v kolku enako, zato smo tretjo hipotezo sprejeli. V MSC iz vseh tkiv se najbolje izraža CD73, najmanj pa CD146, kar je bilo tudi pričakovano, saj je CD146 negativni označevalec humanih skeletnih matičnih celic. Na podlagi rezultatov naše raziskave, predlagamo nadaljne raziskave tega področja na proteinskem nivoju.20202020-06-25 08:45:17Magistrsko delo/naloga117135VisID: 72992sl