Tarčno preurejanje gena za centromerni protein CENH3 pri zelju (Brassica oleracea var. capitata L.) s tehnologijo CRISPR/Cas9Stajič, Ester (Avtor) Bohanec, Borut (Mentor) Murovec, Jana (Komentor) zeljeCRISPR/Cas9tarčno preurejanjeprotoplastigenska transformacijaTarčno preurejanje genoma z uporabo tehnologije CRISPR/Cas9 je vedno pogosteje uporabljen pristop za induciranje tarčnih mutacij tudi pri rastlinah. V naših poskusih smo uporabili deset različnih sgRNA za ciljanje štirih različnih mest v genomu zelja (Brassica oleracea var. capitata L.), med njimi tudi 6 sgRNA za spremembe centromernega proteina CENH3, ki je vključen v ločevanje kromosomov. Rastline z mutiranimi oblikami proteina CENH3 se lahko uporabijo kot opraševalske linije za indukcijo haploidov v procesu pridobivanja hibridov z visoko agronomsko vrednostjo. Za dostavo pripravljenih CRISPR/Cas9 vektorjev v celice rastlin zelja smo uporabili tri različne pristope: transformacijo protoplastov, agroinfiltracijo in stabilno transformacijo z uporabo bakterije Agrobacterium tumefaciens (A. t.). Za detekcijo tarčnih mutacij smo uporabili test z endonukleazo T7E1, sekvenciranje po Sangerju in sekvenciranje naslednje generacije. Slednje je pokazalo uspešno indukcijo tarčnih mutacij za vse testirane sgRNA pri vzorcih poskusov transformacije protoplastov in agroinfiltracije. Odstotki induciranih indel (insercije-delecije) mutacij so bili do 11,95 % po transformaciji protoplastov in do 14,42 % po agroinfiltraciji. Za regeneracijo rastlin z želenimi mutacijami smo optimizirali protokole za regeneracijo protoplastov z uporabo gojenja v alginatnih diskih in protokol za stabilno transformacijo z A. t. Protokoli, izdelani v okviru te doktorske disertacije, bodo pripomogli k uporabi tarčne mutageneze pri žlahtnjenju zelja.[E. Stajič]20202020-03-25 07:15:12Doktorsko delo/naloga114886UDK: 606:602.64:582.683.211(043.3)VisID: 175748COBISS_ID: 9448825sl