IMUNOFENOTIPIZACIJA KRONIČNEGA POLIPOZNEGA IN NEPOLIPOZNEGA RINOSINUZITISASoklič Košak, Tanja (Avtor) Peter, Korošec (Mentor) Hočevar Boltežar, Irena (Komentor) kronični rinosinuzitisKRSkronični sinuzitisnosni polipitežek KRST limfocitiTh1 limfocitiTh17 limfocitiTh2 limfocitiCD8+ limfocitiDN T limfocitigenska ekspresijatranskripcijski faktorjiT-betGATA3RORCFOXP3UVOD: Kronični rinosinuzitis (KRS) je kronično vnetje sluznice nosu in obnosnih votlin, ki traja več kot 12 tednov z občasnimi poslabšanji. KRS razdelimo na polipozni KRS (KRS z nosnimi polipi, KRSwNP) in nepolipozni KRS (KRS brez nosnih polipov, KRSsNP). Vsaj 20% bolnikov ima kljub ustreznemu zdravljenju težek KRS s perzistentnimi motečimi simptomi (ocena ?5 na vizualni analogni lestvici, VAS 0-10) in ponovitvami po endoskopskih operacijah. Raznolikost imunofenotipov - endotipov v sluznici pri KRS še ni dokončno pojasnjena. Podtipi sluzničnih T limfocitov, povezani s težkim KRS, še niso bili raziskani. NAMEN: Namen naše raziskave je bila analiza podtipov sluzničnih T limfocitov pri bolnikih s KRSwNP in bolnikih s KRSsNP, še preden so začeli prejemati nosne ali sistemske glukokortikoide. Za razliko od predhodnih raziskav smo želeli identificirati specifične podtipe sluzničnih T celic, karakteristične za bolnike s težkim KRSwNP in KRSsNP ter za bolnike z urejenim KRSwNP in KRSsNP. Osredotočili smo se na CD8+ citotoksične T limfocite in dvojno negativne CD4-CD8- DN T celice, ki še niso bile opisane pri KRS. Naš dodaten cilj je bila določitev genskih ekspresij glavnih znotrajceličnih transkripcijskih faktorjev podtipov T limfocitov, ki bi lahko kot promotorji in regulatorji vnetnih poti predstavljali potencialne nove tarče topikalnega zdravljenja nosne sluznice z DNAcimi. MATERIALI IN METODE: Prospektivno smo vključili 31 bolnikov z novoodkritim KRS (18 KRSwNP in 13 KRSsNP) s težkimi simptomi, ki do vključitve še niso bili zdravljeni zaradi KRS. Odvzeli smo biopsijo sluznice nosnega polipa v srednjem nosnem hodniku pri bolnikih s KRSwNP ali sluznice s procesus uncinatusa v srednjem nosnem hodniku pri bolnikih s KRSsNP. Vzorce sluznice smo pregledali histopatološko in analizirali s pretočno citometrijo za podtipe T limfocitov (Th1, Th2, Th17, Tc1, Tc17 in DN T celice), aktivacijske markerje (CD69, CD25, HLA-DR) ter označevalce citotoksičnosti (CD28, CD27). Pri 22 bolnikih (14 KRSwNP in 8 KRSsNP) smo izmerili nivoje genskih ekspresij glavnih transkripcijskih faktorjev T-box transkripcijski faktor (T-bet, TBX21), GATA binding protein 3 (GATA3), Retinoic acid-related orphan receptor C (RORC) in Forkhead box P3 (FOXP3) s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo z reverzno transkriptazo (RT-qPCR). Bolnike smo zdravili in jih redno ambulantno spremljali povprečno 24 do 36 mesecev; težek KRS je kljub zavzetemu medikamentoznemu in endoskopskemu kirurškemu zdravljenju imelo 5 od 18 bolnikov s KRSwNP in 5 od 13 bolnikov s KRSsNP. Statistično analizo podatkov smo naredili s programom GraphPad Prism 6.0. REZULTATI: Sluznična eozinofilija z >10 eozinofilci / HPF je bila pogostejša pri bolnikih s KRSwNP kot pri bolnikih s KRSsNP. Bolniki s KRSwNP so imeli v primerjavi z bolniki s KRSsNP več CD4+ T limfocitov in zvišano število aktiviranih CD4+CD25+ T celic, kar kaže na Th-posredovano vnetje. Th1 celice so bile pomnožene v sluznici pri KRSwNP, vendar niso imele vpliva na kontrolo bolezni pri KRSwNP. Bolniki s KRSsNP so imeli zvišano število CD8+ T limfocitov in pomnožene efektorsko citotoksične CD8+CD28-CD27- T celice ob hkrati znižanem številu centralno spominskih CD8+CD28+CD27+ T celic, kar pomeni prevladujoče citotoksično vnetje pri bolnikih s KRSsNP. To potrjuje tudi rezultat, da so imeli bolniki s težkim KRSsNP še dodatno zvišano število CD8+ T celic v sluznici. Pri bolnikih s KRSwNP in bolnikih s KRSsNP smo našli pomembno visok delež (10-20%) sluzničnih DN T celic, presenetljivo višji od normalnega 1-5% deleža. Med DN T limfociti so prevladovali efektorsko citotoksični CD28-CD27- DN T, le malo je bilo centralno spominskih CD28+CD27+ DN T celic. Po naših podatkih je to prva raziskava, ki je našla tako visoko število DN T limfocitov v sluznici pri KRS. Pri bolnikih s težkim KRSwNP je bilo število vnetnih DN T celic 3-krat višje in manj je bilo delno diferenciranih, efektorsko spominskih DN T kot pri bolnikih z urejenim KRSwNP. Izvor DN T celic pri KRS trenutno ni pojasnjen, lahko pa bi bile pomemben proizvajalec IL-5, glavnega citokina vnetja tipa 2. Pri urejenem KRSwNP je bilo zvišano število Th17 celic, ki verjetno predstavljajo normalen homeostatski imunski odziv zdrave nosne sluznice. Pri urejenem KRSsNP so bile pomnožene DN T celice, ki bi lahko pri teh bolnikih imele regulatorno supresorsko vlogo in bi lahko omejevale škodljivo CD8+ celično aktivacijo ter poškodbe sluznice. Pri bolnikih z eozinofilnim KRSwNP smo s povečano gensko ekspresijo GATA3 mRNA v primerjavi z bolniki z neeozinofilnim KRSwNP potrdili vnetje tipa 2. Vendar verjetno pri vnetju tipa 2 sodelujejo tudi DN T celice, a njihov glavni transkripcijski faktor zaenkrat še ni znan. Pri bolnikih s KRSsNP smo nepričakovano ugotovili simultano zvišane nivoje genskih ekspresij T-bet, GATA3 in RORC v primerjavi z bolniki s KRSwNP; domnevamo, da bi lahko te visoke genske ekspresije vseh treh glavnih transkripcijskih faktorjev za efektorske T celice izvirale iz pomnoženih efektorsko citotoksičnih, aktiviranih CD8+ T celic v sluznici pri KRSsNP. ZAKLJUČKI: Bolniki s KRS so se razlikovali po podtipih sluznični T limfocitov: bolniki s KRSwNP so imeli več CD4+ T celic, bolniki s KRSsNP pa več CD8+ T celic s pomnoženimi efektorsko citotoksičnimi CD8+CD28-CD27- T limfociti. Prvič smo v sluznici KRS našli pomnožene DN T celice, med katerimi so prevladovale efektorsko citotoksične celice. Ta raziskava je prva analizirala podtipe T limfocitov, povezane s kontrolo KRS. Potentne efektorske aktivirane DN T celice, ki jih je bilo v sluznici pri težkem KRSwNP 3-krat več, verjetno igrajo pomembno vlogo v patogenezi težkega KRSwNP, bi morda lahko predstavljale novo tarčo zdravljenja in jih je potrebno še podrobneje raziskati. Obratno pa morda DN T limfociti pri bolnikih s KRSsNP delujejo regulatorno supresorsko in zavirajo škodljivo citotoksično vnetje v sluznici. Nepričakovano visoke genske ekspresije vseh treh glavnih transkripcijskih faktorjev za efektorske T limfocite pri bolnikih s KRSsNP, ki kažejo na pomnožene efektorske aktivirane T celice v sluznici, so trenutno nepojasnjene; najverjetneje izvirajo iz aktiviranih, efektorsko citotoksičnih CD8+ celic. Naši rezultati so tako znanstveno kot tudi klinično aplikativni. V perspektivi razvijanja novih strategij topikalnega nosnega zdravljenja z DNAcimi je potrebno upoštevati dinamično ravnotežje koekspresij dveh različnih glavnih transkripcijskih faktorjev v efektorskih in regulatornih T limfocitih. Prispevajo k razumevanju patogeneze vnetja v sluznici pri bolnikih s KRSwNP in bolnikih s KRSsNP, kar bo v prihodnosti nadgradilo diagnostiko KRS z novimi biomarkerji, modificiralo obstoječe algoritme zdravljenja in omogočilo personalizirano obravnavo bolnikov s KRS. Specifični imunofenotipi - endotipi v sluznici bolnikov s KRS bodo v prihodnosti odločali o vrsti medikamentoznega in obsegu endoskopskega kirurškega zdravljenja, ki postopoma ne bo več enako za vse, ampak bo prilagojeno bolniku, kar bo še posebej pomembno za bolnike s težkim KRS.20202020-03-19 07:15:09Doktorsko delo/naloga114839VisID: 13063COBISS_ID: 20006659sl