Priprava in osnovna biokemijska karaterizacija treh tipov metakaspaz iz algGoršek, Nika (Avtor) Klemenčič, Marina (Mentor) Cisteinske proteazemetakaspazeGtMC1CrMC2GtMC2Guillardia thetaChlamydomonas reinhardtiiProgramirana celična smrt ima pomembno vlogo pri rasti, razvoju in ohranjanju večceličnega organizma. Proces je vključen v ohranjanje velikosti tkiva, embrionalni razvoj, nastajanje okončin, odstranjevanje poškodovanih in okuženih celic ter v delovanje imunskega sistema. Apoptoza je poleg nekroze in avtofagije ena izmed glavnih tipov programirane celične smrti. Ključno vlogo pri poteku apoptoze imajo cisteinske proteaze, imenovane kaspaze. Tudi pri rastlinah je programirana celična smrt pomembna za razvoj in interakcije z okoljem. Med rastlinsko in živalsko celično smrtjo obstajajo določene razlike. Celična stena rastlin onemogoča nastajanje apoptotskih telesc, odsotnost fagocitov onemogoča odstranjevanje ostankov celic, v samih rastlinskih genomih pa ni zapisa za regulatorje apoptoze, družin Bcl-2, Bax in kaspaz. Najdemo pa lahko zapise za metakaspaze. Te proteaze so strukturni homologi kaspaz, ki prav tako vsebujejo katalitično diado sestavljeno iz cisteina in histidina. Od kaspaz se razlikujejo v substratni specifičnosti. Metakaspaze cepijo za pozitivno nabitim aminokislinskim ostankom za razliko od kaspaz, ki cepijo za negativno nabitim aminokislinskim ostankom. Razlikujejo pa se tudi v aktivaciji cimogenov. Ta je pri metakaspazah odvisna od kalcijevih ionov, pri kaspazah pa je avtokatalitično procesiranje odvisno od dimerizacije. Metakaspaze glede na razporeditev domen p20 in p10 razdelimo na tri tipe. Pri tipu I si domeni sledita ena za drugo, na N-končnem delu pa je prisotna tudi prodomena, ki se po proteolitičnem procesiranju odstrani. Za tip II je značilna dolga povezovalna regija med domenama p20 in p10. Pri tipu III pa je domena p10 pred domeno p20. Cilj diplomskega dela je bila izraziti in izolirati rekombinantne metakaspaze vseh treh tipov ter določitev njihovih osnovnih biokemijskih lastnosti. Kot predstavnika metakaspaz tipov I in III smo uporabili metakaspazi iz alge Guillardia theta, kot predstavnika tipa II pa smo uporabili metakaspazo modelne zelene alge Chlamydomonas reinhardtii. Za pripravo proteinov smo uporabili ekspresijski sistem Escherichia coli, sev BL21[DE3]. Za določevanje encimske aktivnosti proteaz smo uporabili substrata FITC-kazein in Z-FR-AMC, ki ima pred mestom cepitve pozitivni aminokislinski ostanek. Meritve encimske aktivnosti so pokazale, da vse tri metakaspaze za delovanje potrebujejo milimolarne koncentracije kalcijevih ionov. Pri optimalnem pH pa si metakaspaze niso tako enotne. Metakaspazi 1 in 2 iz organizma G. theta najbolje delujeta pri pH 6,0, metakaspaza 2 iz C. reinhardtii pa za optimalno delovanje potrebuje pH 8,5.20202020-02-24 10:40:01Diplomsko delo/naloga114373VisID: 6333COBISS_ID: 1538536643sl