Tarčna integracija heterolognih genov monoklonskega protitelesa v genom celic CHOVivod, Petra (Avtor) Gunčar, Gregor (Mentor) tarčna integracijaNHEJsuper-ojačevaleccelice CHOCelice CHO sože vrsto let vodilni ekspresijski sistem za proizvodnjo bioloških zdravil. Trenutni razvoj celičnih linij temelji na naključni integraciji ekspresijskega vektorja v genom celic CHO, s čimer pridobimo klone, ki se med sabo zelo razlikujejo tako v stopnji kot tudi stabilnosti produkcije proteinov. Za razvoj visoko producirajoče celične linije, je tako potrebno generirati in presejati ogromno število klonov. Predpostavili smo, da bi s tarčno integracijo mAb ekspresijskega vektorja v regije genoma celic CHO, ki se nahajajo blizu super-ojačevalcev določenih z metodo ATAC-seq, lažje in hitreje razvili visoko producirajočo celično linijo. V okviru magistrske naloge smo želeli vzpostaviti enostaven in učinkovit način tarčne integracije. Za vstavitev lineariziranega mAb ekspresijskega vektorja v tarčno mesto smo izkoristili popravljalni mehanizem spajanja nehomolognih koncev, ki sodeluje pri popravilu dvojnega preloma DNA. Prelom dvojne vijačnice smo v celicah tarčno sprožili z uporabo orodja za urejanje genoma. Z razvito metodo smo dosegli učinkovitost tarčne integracije med 3 in 11 %, odvisno od učinkovitosti delovanja sistema za urejanje genoma in tarčne regije. V drugem delu magistrske naloge smo pri klonih s tarčno integriranim ekspresijskim vektorjem ovrednotili vpliv super-ojačevalcev na izražanje heterolognih genov ter na produktivnost posameznih klonov. Pokazali smo, da s tarčno integracijo dosežemo 1,7-krat višjo stopnjo izražanja heterolognih genov ter 1,5-krat višjo specifično produktivnost. Z analizo,v kateri smo ugotavljali stopnjo izražanja heterolognega gena na posamezno kopijo ekspresijskega vektorja pa smo ugotovili, da med kloni s tarčno in naključno integracijo ni statistično pomembne razlike. Poleg tega smo pokazali, da z metodo tarčne integracije na osnovi popravljalnega mehanizma spajanja nehomolognih koncev v genom celic CHO integriramo večje število kopij heterolognega gena kot z naključno integracijo. V okviru magistrske naloge smo torej uspeli razviti način za pripravo celičnih linij z izboljšano produktivnostjo.20202020-01-29 12:05:01Magistrsko delo/naloga113722VisID: 5041COBISS_ID: 1538524611sl