Heterologno izražanje genov za zunajcelične encime glive Aureobasidium pullulans v kvasovki Saccharomyces cerevisiaeKustec, Anita (Avtor) Gunde Cimerman, Nina (Mentor) Zunajcelični encimgenAureobasidium pullulansSaccharomyces cerevisiaeAureobasidum pullulans je vrsta črne kvasovke, ki je znana predvsem po svoji biotehnološki vlogi kot proizvajalec polisaharida pululan in cele vrste zunajceličnih encimov. Izraba le-teh je zaenkrat omejena, vendar nedavna določitev genomskega zaporedja vrste A. pullulans predstavlja izjemno priložnost za identifikacijo in preučitev encimov te glive. Za A. pullulans je značilna tudi toleranca na različne stresne pogoje kot so nizka vodna aktivnost, visoke koncentracije soli, nizek pH. Pivska ali pekovska kvasovka Saccharomyces cerevisiae je uveljavljen laboratorijski modelni sistem. Ker vrsta S. cerevisiae ni patogena, lahko z njo brez težav rokujemo v mikrobiološkem laboratoriju ob običajnih varnostnih ukrepih. Kvasovka je pomembna v živilski industriji pri vzhajanju testa in proizvodnji alkoholnih pijač, pa tudi v energetiki za proizvodnjo bioetanola za gorivo, zaradi česar je spreminjanje njenih industrijsko relevantnih lastnosti zelo zaželeno. Namen magistrskega dela je bil izbrati gene za zunajcelične encime, ki imajo potencial za uporabo v industriji. Namen dela je bil tudi izražanje teh genov v laboratorijskem sevu pivske kvasovke in njihova osnovna karakterizacija. Pri raziskovalnem delu smo najprej identificirali gene za encime A. pullulans. Sledilo je pomnoževanje teh genov z verižno reakcijo s polimerazo in ločevanje pomnožkov z agarozno gelsko elektroforezo. Naslednja stopnja je bilo čiščenje pomnožkov in vstavljanje v plazmid pBEVY-U. Sledila je transformacija S. cerevisiae. Dobljene transformante smo preverili z verižno reakcijo s polimerazo in z določanjem nukleotidnega zaporedja vstavljenih genov. V naslednji stopnji smo preverjali funkcijo vstavljenih genov na gojiščih za zaznavo ustreznih encimskih aktivnosti. Nazadnje pa smo preverili delovanje izbranih encimov med rastjo gensko spremenjene kvasovke S. cerevisiae v stresnih pogojih. A. pullulans je namreč znana kot ekstremnotoleranten organizem, ker raste tudi pri povišani koncentraciji soli in pri različnih temperaturah. Zato smo delovanje zunajceličnih encimov, za katere smo zapise vnesli v S. cerevisiae, preverjali pri povišani slanosti in pri različnih temperaturah. Gene za zunajcelične encime A. pullulans smo uspeli izraziti v S. cerevisiae. Nenazadnje pa smo uspeli dokazati, da encimi iz A. pullulans delujejo tudi v stresnih pogojih ob dodatku natrijevega klorida v gojišče.20192020-01-08 12:46:54Magistrsko delo/naloga113456VisID: 3320COBISS_ID: 1538480067sl