Opredelitev lastnosti mutantov perfringolizina O s spremembami v holesterol-prepoznavnem deluSotlar, Inge (Avtor) Anderluh, Gregor (Mentor) Novinec, Marko (Komentor) od holesterola odvisni citoliziniperfringolizin Olipidna membranaholesterolToksin perfringolizin O (PFO) je pomemben virulenčni dejavnik grampozitivne bakterije Clostridium perfringens in ga uvrščamo v družino od holesterola odvisnih citolizinov, ki v membranah tarčnih celic tvorijo pore. Znano je, da se PFO veže na holesterol-vsebujoče membrane preko štirih zank v domeni 4 (D4). Ključni vpliv pri vezavi holesterola ima aminokislinski motiv T490-L491 v zanki L1. Točni molekularni mehanizem prepoznave membranskega holesterola še ni pojasnjen. Cilj magistrske naloge je bil opredeliti vpliv zamenjav aminokislinskih ostankov v zankah v D4 na aktivnost mutantov toksina PFO. Mutante PFO smo izrazili v baterijskem ekspresijskem sistemu E. coli in jih uspešno očistili z Ni-NTA afinitetno ter gelsko izključitveno kromatografijo. Potrdili smo, da imajo pravilno aminokislinsko zaporedje in molekulsko maso, z izjemo enega mutanta. Ugotovili smo, da se mutanti PFO z zamenjavami v paru T490-L491 vežejo na multilamelarne vezikle s 50 mol % holesterola. Vezave izbranih mutantov PFO na vezikle s 50 mol % holesteril acetata nismo opazili. Vpliv mutacij na aktivnost izbranih mutantov PFO smo opredelili z merjenjem hemolitične aktivnosti, kjer smo v skladu s predvidevanji ugotovili, da mutacije aminokislinskih ostankov različno vplivajo na aktivnost. Z metodo površinske plazmonske resonance (SPR) smo ugotovili, da se pri zamenjavi A401W afiniteta do holesterola poveča, medtem ko je zaradi aminokislinskih zamenjav v holesterol-prepoznavnem motivu (T490 in L491) afiniteta do holesterola manjša. Dokazali smo, da so se izbrani mutanti kljub zamenjavam v predlaganem holesterol-vezavnem motivu zmožni vezati na membrane s holesterolom.20192019-12-20 09:05:01Magistrsko delo/naloga113324VisID: 5024COBISS_ID: 1538509507sl