Priprava in karakterizacija od kalcija odvisnega transkripcijskega dejavnika na osnovi kalmodulina in od kalcija in kalmodulina odvisne protein kinaze IIFuhrmann, Sara Kimm (Avtor) Benčina, Mojca (Mentor) Dolinar, Marko (Komentor) sintezna biologijaumetni transkripcijski dejavnikikalmodulinefektorji TALTranskripcijski dejavniki so nepogrešljivi elementi sintezne biologije. Ker je število dobro okarakteriziranih in ortogonalnih naravnih transkripcijskih dejavnikov omejeno, želimo s pripravo umetnih transkripcijskih dejavnikov omogočiti načrtovanje obširnejših sinteznih genetskih vezij. V okviru magistrske naloge smo želeli pripraviti sistem za uravnavanje izražanja genov na osnovi interakcij med kalmodulinom in njegovim tarčnim peptidom iz od kalcija in kalmodulina odvisne protein kinaze II, katerega aktivnost bi lahko nadzorovali z uravnavanjem znotrajcelične koncentracije prostih kalcijevih ionov. Pripravili smo transkripcijski dejavnik iz dveh delov. Prvi del smo pripravili s fuzijo tarčnega peptida MKII in DNA-vezavne domene efektorja TAL, drugi del pa s fuzijo kalmodulina in aktivacijske domene VPR. Pripravili smo več konstruktov z različnim zaporedjem domen. Učinkovitost aktivacije transkripcije poročevalskega gena smo spremljali z dvojnim luciferaznim testom v celicah HEK293T. Pričakovali smo, da se bo načrtovani transkripcijski dejavnik ustrezno sestavil in sprožil izražanje poročevalskega gena ob stimulaciji celic s kalcijevim ionoforom A23187 in posledičnem dvigu znotrajcelične koncentracije kalcija. Testirali smo konstrukte z različnim zaporedjem domen kalmodulin/VPR in MKII/efektor TAL in spreminjali količine in razmerja posameznih vektorjev z zapisom za del transkripcijskega dejavnika. Učinkovite aktivacije transkripcije nismo dosegli v nobenem primeru. Neaktivnost pripravljenega sistema bi lahko bila posledica več dejavnikov, kot so nezadostno izražanje, neenakomerna transfekcija celic z obema deloma transkripcijskega dejavnika, neustrezna znotrajcelična lokalizacija posameznih konstruktov, nezmožnost sestave delov transkripcijskega dejavnika v aktivno celoto ter interakcije z endogenimi proteini.20192019-11-04 13:50:01Magistrsko delo/naloga112680VisID: 4956COBISS_ID: 1538495683sl