Priprava vektorjev z zapisi za proteinske nanostrukture z metodo sestavljanja Golden GateUlčnik, Tadej (Avtor) Gradišar, Helena (Mentor) Dolinar, Marko (Komentor) Golden Gatemodularnostovite vijačniceNačrtovanje in priprava novih bionanomaterialov predstavljata pomembno področje hitro razvijajoče se nanotehnologije. Molekularno samosestavljanje nam omogoča pripravo novih proteinskih nanomaterialov, ki so pametni, prilagodljivi, biokompatibilni in biološko razgradljivi. Nov tip načrtovanih proteinskih nanostruktur, ki se samosestavijo iz ene polipeptidne verige, predstavlja izjemen potencial za različne aplikacije. Polipeptidna veriga je sestavljena iz več med seboj povezanih peptidnih modulov. Takšna modularna zgradba je zelo primerna za uporabo metode sestavljanja Golden Gate, ki omogoča ligacijo več delov oziroma modulov DNA naenkrat. Metoda temelji na uporabi restrikcijskih endonukleaz tipa IIs in DNA-ligaze T4. Tovrstni restrikcijski encimi režejo DNA izven svojih prepoznavnih mest, kar omogoča rezanje več različnih zaporedij DNA z uporabo enega encima. Na ta način se skrajša čas priprave konstruktov, saj poteka celoten proces v eni stopnji. Z načrtovanim vstavljanjem prepoznavnih mest za restrikcijske encime pa lahko določimo tudi vrstni red modulov. Pripravili smo zapis za protein s trikotno strukturo z molekulami fluorescenčnega proteina na ogliščih. Protein je sestavljen iz devetih modulov v definiranem vrstnem redu. Šest modulov tvori tri pare ovitih vijačnic, ki predstavljajo stranice trikotnika, trije moduli pa vsebujejo zapis za fluorescenčni protein. Vsako stranico predstavlja homodimerna ovita vijačnica, dolga 15 heptad aminokislinskih ostankov. Uporabili smo nekoliko spremenjena zaporedja naravnih homodimerov tropomiozina, Rho-kinaze ter korteksilina. Struktura ovite vijačnice zagotavlja strukturno stabilnost proteina, hkrati pa omogoča in vivo samosestavljanje proteina do načrtovane geometrijske oblike. Z načrtovanjem nukleotidnega zaporedja je bilo predhodno pripravljenih devet modulov, vsak velikosti od 300 do 700 baznih parov, z vezavnima mestoma za restrikcijsko endonukleazo tipa IIs BsaI. Z uporabo metode Golden Gate nam je uspelo izrezati in v pravilnem zaporedju ligirati v končni vektor okoli 4000 baznih parov dolg zapis iz devetih, v določenem vrstnem redu povezanih modulov. Izvedli smo tudi optimizacijo metode Golden Gate. Metodo smo želeli izboljšati do te mere, da bi se lahko uporabljala za sestavljanje zapisov iz več kot 12 modulov. Optimirali smo reakcijske pogoje, pri čemer smo spreminjali količino encimov ligaze in BsaI ter ATP. Preverili smo več različnih pristopov in najuspešnejši je bil pristop s predhodnim sestavljanjem krajših segmentov v več ločenih reakcijah. V tem primeru v ločenih reakcijah najprej med seboj sestavimo krajše segmente, ki jih nato združimo, ligiramo in vstavimo v vektor. Na ta način nam je uspelo pripraviti zapisa za proteina, ki sta sestavljena iz 12 oziroma 18 modulov.20192019-09-23 11:50:08Magistrsko delo/naloga111086VisID: 5034COBISS_ID: 1538446019sl