Razvoj metode za merjenje koncentracij kanabidiola in tetrahidrokanabinola ter nekaterih njunih metabolitov v človeški krvni plazmiKočevar, Marko (Avtor) Trontelj, Jurij (Mentor) epilepsijakanabinoidiS9 frakcijatekočinska kromatografijavalidacija metodeLC-MS/MSKanabidiol (CBD) in ?9-tetrahidrokanabinol (THC) sta dva kanabinoida iz konoplje, ki pri strokovni javnosti vzbujata vse več zanimanja za njuno terapevtsko uporabo. Glavni namen magistrske naloge je bil razviti metodo za merjenje koncentracij CBD, THC, 11-hidroksi-THC (THC-OH) in 11-karboksi-THC (THC-COOH) v človeški krvni plazmi, ki bo ustrezala namenom klinične študije zdravljenja refraktarne epilepsije pri otrocih. Med razvojem priprave vzorca smo preizkusili 5 različnih tekočinskih ekstrakcij, 18 vrst kartuš za ekstrakcijo na trdnem nosilcu, 1 filter in 2 kartuši za podprto tekočinsko ekstrakcijo. Med vsemi se je za najustreznejšo izkazala ekstrakcija tekoče-tekoče z zmesjo topil heksana in etilacetata v razmerju 9 : 1. LC-MS/MS metodo smo razvili s tekočinskim kromatografom sklopljenim s tandemskim kvadrupolnim masnim spektrometrom. Analite smo kromatografsko ločili z gradientnim programom z 0,2 mM amonijevim fluoridom in acetonitrilom na analitski koloni Kinetex C18 (50 mm × 2,1 mm, 2,6 µm). Umeritvene krivulje smo pripravili z osmimi kalibratorji v območju 1–100 µg/L za THC in 6–100 µg/L za THC-OH ter z desetimi kalibratorji v območju 1–1000 µg/L za CBD in 2,5–1000 µg/L za THC-COOH. Kot interne standarde smo uporabljali izotopno označene analoge analitov: CBD-d3, THC-d3 in THC-COOH-d3. Z namenom preverjanja selektivnosti analizne metode smo poskušali z jetrno S9 frakcijo in vitro pripraviti metabolite CBD, predvsem 7-karboksi-CBD, ki komercialno ni bil dostopen. Analizno metodo smo vrednotili po smernicah za validacijo bioanaliznih metod. Točnost in ponovljivost sta bili pri CBD, THC in THC-COOH v območju 88–110 % ter 1,1–8,1 %, pri THC-OH pa v območju 97–117 % ter 2,0–15,8 %. Vzorce lahko z redčenjem točno in ponovljivo analiziramo do 5-kratnika zgornje meje kvantifikacije. Stabilnost analitov v plazmi smo dokazali za 17 dni pri –80 °C, tri cikle zamrzovanja in odtajanja, štiri ure pri sobni temperaturi in 36 ur v avtomatskem vzorčevalniku pri 10 °C. Pri CBD, THC in THC-COOH smo dokazali odsotnost relativnega učinka matrice. Razvita metoda za namene klinične študije omogoča merjenje CBD v plazmi v koncentracijskem območju 1–5000 µg/L, THC 1–500 µg/L, THC-COOH 2,5–5000 µg/L in THC-OH 6–500 µg/L.20192019-09-21 08:35:02Magistrsko delo/naloga110998VisID: 70403sl