Sinteza konjugatov lektin-koloidno zlato za lokalizacijo sladkornih preostankov v urotelijskih celicahGrdadolnik, Maja (Avtor) Zupančič, Daša (Mentor) koloidno zlatolektinlektinska histokemijapresevna elektronska mikroskopijaLektini so glikoproteini, ki specifično prepoznajo in se vežejo na sladkorne preostanke v celicah. Koloidno zlato je suspenzija nanometrskih delcev zlata v vodnem mediju, ki se uporablja kot označevalec v elektronski mikroskopiji. Lektine, konjugirane s koloidnim zlatom velikosti od 5 do 20 nm, lahko uporabljamo v presevni elektronski mikroskopiji za označevanje sladkornih preostankov v zdravih in patološko spremenjenih vzorcih. V magistrski nalogi smo uporabili tri metode za sintezo delcev koloidnega zlata velikosti 20 nm in 10 nm. Po citratni metodi CM-20nm-1 in obratni citratni metodi OCM-10nm smo uspešno sintetizirali koloidno zlato, po citratni metodi CM-20nm-2 pa se je koloidno zlato oborilo. Z lektinoma ACA in jakalin (Jac), ki specifično prepoznata galaktozil(β-1,3)N-acetilgalaktozamin smo konjugirali koloidno zlato, sintetizirano po metodah CM-20nm-1 in OCM-10nm. Uspešnost sinteze koloidnega zlata in konjugacije z lektinoma smo preverjali s presevnim elektronskim mikroskopom (TEM) ter spektrofotometrom za merjenje UV-VIS spektra (190 nm do 900 nm). Rezultati TEM in UV-VIS spektroskopije so pokazali, da so delci koloidnega zlata sintetizirani po metodah CM-20nm-1 in OCM-10nm veliki okoli 16 nm. Uspešnosti konjugacije s TEM nismo mogli potrditi, s UV-VIS spektroskopijo pa smo potrdili, da je bila konjugacija lektinov ACA in Jac s koloidnim zlatom uspešna. Čeprav nam ni uspelo sintetizirati koloidnega zlata različnih velikosti, smo uspeli pokazati, da sta postopek sinteze koloidnega zlata velikosti okoli 16 nm in nadaljnja konjugacija z lektinoma ACA in Jac enostavna in ponovljiva. Na parafinskih rezinah mišjega sečnega mehurja in korteksa ledvic smo izvedli lektinsko histokemijo s fluorescenčno označenimi lektini (ACA-FITC in Jac-FITC), ki so pokazali vezavo na obrobne dele urotelijskih celic ter na distalne tubule in glomerule korteksa ledvic. Tkivo mišjega korteksa ledvic smo zato izbrali za pozitivno kontrolo, ker sta se konjugata ACA-FITC in Jac-FITC specifično vezala na glomerule in distalne tubule. Da bi lahko ugotovili ultrastrukturno lokalizacijo sladkornih preostankov v urotelijskih celicah, smo izvedli lektinsko histokemijo na ultratankih rezinah mišjega sečnega mehurja. Uporabili smo različne načine kemijske fiksacije (4-odstotni FA/PHEM ali 1-odstotni GA/PHEM) in vklapljanja tkiva sečnega mehurja ter primerjali specifičnost vezave komercialno dostopnih konjugatov lektin-koloidno zlato s konjugati lektin-koloidno zlato, ki smo jih sintetizirali. Ugotovili smo, da je vezava sintetiziranih in komercialno dostopnih konjugatov na krioultratankih rezinah in ultratankih rezinah, vklopljenih v umetno smolo Lowicryl K4M, nespecifična. Vzrok za nespecifično vezavo je najverjetneje sprememba sladkornih preostankov, ki je posledica vklapljanja v umetno smolo Lowicryl K4M oziroma v želatino pri pripravi krioultratankih rezin. Ta sklep potrjujejo tudi rezultati pozitivne kontrole, saj se lektina ACA in Jac specifično vežeta na parafinske rezine (kemijska fiksacija s 4-odstotnim FA/PHEM), nasprotno pa je vezava na krioultratanke rezine (kemijska fiksacija s 4-odstotnim FA/PHEM ali z 1-odstotnim GA/PHEM) korteksa ledvic nespecifična.20192019-09-12 16:50:20Magistrsko delo/naloga110201VisID: 4454COBISS_ID: 34490585sl