Vpliv mutacij v plaščnem proteinu virusa Y krompirja na biokemijske in biofizikalne lastnosti ter zgradbo virusom podobnih delcevSrnko, Marija (Avtor) Podobnik, Marjetka (Mentor) Plavec, Janez (Komentor) Virus Y krompirjavirusom podobni delcicisteinVirusom podobni delci (angl. virus-like particles, VLPs) so strukturno podobni virusom, iz katerih so pridobljeni, a za razliko od izvornih virusov nimajo prisotnega virusnega genetskega materiala. Lastnosti VLP-jev, ki doprinašajo k vedno večjemu pomenu VLP-jev na področju nanobiotehnoloških aplikacij, so simetrična ureditev plaščnih proteinov, enostavne metode izolacije, dovzetnost za genske in proteinske modifikacije in varna uporaba v bioloških sistemih. Virus Y krompirja (angl. potato virus Y, PVY) tvori do 740 nm dolge in 13 nm široke virione, plaščni proteini pa se ob izražanju v bakterijskem ekspresijskem sistemu ter odsotnosti virusne RNA samosestavijo v do 3 µm dolge in 13 nm široke nitaste fleksibilne delce. V raziskovalni skupini, kjer sem opravljala magistrsko nalogo, so določili tridimenzionalno strukturo virusa PVY in ustreznega VLP-ja s pomočjo krio-elektronske mikroskopije pri ločljivosti blizu atomske. V primeru VLP-ja so ugotovili, da ena enota plaščnega proteina (angl. coat protein, CP) sestavlja osemčlenske obroče, ki se med seboj sestavljajo v dolge nitke. Namen mojega magistrskega dela je bil pripraviti take rekombinantne oblike CP-ja, ki bi dale nastalim VLP-jem posebne lastnostni za nadaljno uporabo v različne bionanotehnološke namene. Na podlagi znane strukture VLP-ja smo pripravili mutante CP-ja tako, da smo določene aminokislinske ostanke, izpostavljene na površini VLP nitke, zamenjali s cisteinskim ostankom. Po izražanju v Escherichia coli smo samosestavljanje mutiranih CP-jev v VLP-je potrdili s presevnim elektronskim mikroskopom. Da uvedba mutacij ni vplivala na sekundarno strukturo plaščnega proteina smo pokazali s cirkularnim dikroizmom. O termični stabilnosti smo sklepali na podlagi temperatur denaturacije, ki smo jih določili z metodo dinamične diferenčne fluorimetrije. Izkazalo se je, da je vpliv sprememb pH in ionske jakosti na termično stabilnost mutantov primerljiv z vplivom na stabilnost PVY VLP-jev. Prisotnostnost uvedenih reaktivnih tiolnih funkcionalnih skupin na površini VLP-jev smo pokazali z vezavo fluorescenčnega barvila Alexa Fluor 488, ki specifično prepozna tiolne funkcionalne skupine. Termično tabilni ter biokemijsko in biofizikalno okarakterizirani PVY VLP-ji s površinsko prisotnimi reaktivnimi tiolnimi funkcionalnim skupinami so prvi PVY VLP-ji s tovrstno modifikacijo in tako odpirajo nove možnosti za modificiranje fleksibilnih nitastih delcev.20192019-09-11 10:20:08Magistrsko delo/naloga110030VisID: 5030COBISS_ID: 6731290sl