Priprava plazmidnega vektorja in molekulsko kloniranje genov Sox5 in Sox6Mezgec, Klemen (Avtor) Marc, Janja (Mentor) Kodrič, Klemen (Komentor) molekulsko kloniranjetranskripcijski dejavnikiSOX5SOX6bioinformacijska sekvenčna analizaBliskovit napredek molekulske biologije nam omogoča enostavno sintezo poljubnih rekombinantnih molekul DNA, ki jih lahko učinkovito izkoriščamo za preučevanje fizioloških in patofizioloških molekulskih mehanizmov v organizmu. Proteini iz družine SOX so izjemno pomembni transkripcijski dejavniki, ki preko ojačevalnih in regulatornih regij uravnavajo izražanje številnih genov, pomembno vpletenih v nadzor celične delitve in sposobnosti diferenciacije v procesu razvoja zarodka. Njihova funkcija v organizmu je tako pomembna, da bi morebitne mutacije v genskem zapisu povzročile razvoj izjemno težkih in kompleksnih bolezenskih stanj. Glavni namen naloge je bil pripraviti ekspresijske plazmide s tehnologijo rekombinantne DNA in tako sklonirati tarčni kodirajoči zaporedji genov SOX5 in SOX6. Sintetizirane rekombinantne plazmidne molekule bodo v transfeciranih celičnih linijah omogočile sintezo označenih fuzijskih proteinov SOX5 in SOX6, ki ju bomo v nadaljnjih študijah uporabili za preučevanje vpletenosti v molekulske mehanizme uravnavanja izražanja tarčnih genov pri razvoju drugih bolezni. Rekombinantne plazmidne molekule smo sintetizirali tako, da smo v poliklonska mesta ekspresijskih vektorjev pFLAG-CMVTM-2 vstavili tarčni kodirajoči zaporedji genov SOX5 in SOX6. V procesu klasičnega molekulskega kloniranja smo za rezanje plazmida in vključkov uporabili restrikcijski endonukleazi NotI ter KpnI, ki sta načrtno ustvarili komplementarne lepljive konce in tako zagotovili pogoje za vstavitev vključkov v rezane molekule vektorja. Po ligaciji smo rekombinantne plazmidne molekule ločili in namnožili na trdnem gojišču z ampicilinom. V zadnjem koraku smo ustreznost molekulskega kloniranja preverili s potrditveno restrikcijsko analizo in elektroforezo na agaroznem gelu ter določitvijo nukleotidnega zaporedja rekombinantnih DNA po Sangerju. Na podlagi rezultatov potrditvenih metod smo ugotovili, da je bilo kloniranje v obeh primerih uspešno. Dokončno potrditev smo dokazali z bioinformacijsko sekvenčno analizo pridobljenih rekombinantnih plazmidov, kjer smo dokazali približno 99 % ujemanje z ustreznima referenčnima različicama tarčnih kodirajočih zaporedij genov SOX5 in SOX6. Transkripcijski dejavniki iz družine SOX so zaradi svoje vsestranskosti in vpletenosti v številne fiziološke ter patofiziološke procese, primerni za nadaljnje raziskave, saj bi nam boljše poznavanje molekulskih mehanizmov lahko omogočilo odkritje novih označevalcev, terapevtskih tarč in inovativnih zdravilnih učinkovin.20192019-09-10 08:35:18Magistrsko delo/naloga109902VisID: 69493sl