Priprava rekombinantnega aneksina A11 v bakterijah E. coli z uporabo ekspresijskih vektorjev na osnovi pMCSG7Maklin, Ana (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) aneksin A11amiotrofična lateralna sklerozaproteinski agregatiizolacija proteinaAmiotrofična lateralna skleroza (ALS) je progresivna in smrtna bolezen, ki jo povzroči degeneracija motoričnih nevronov. Ne dolgo nazaj so z ALS povezali mutacije v genu ANXA11. Aneksin A11 (ANXA11) spada v naddružino aneksinov, strukturno sorodnih proteinov, ki se v prisotnosti kalcija vežejo na celično membrano. Večino proteinske strukture sestavljajo štiri visoko ohranjena homologna α-vijačna zvitja, medtem ko je N-končna regija zelo variabilna. N-konec ANXA11 je nestrukturiran in najdaljši v družini aneksinov. Pomemben je za jedrno lokalizacijo in razgradnjo ANXA11. Rekombinantni protein je v svojem magistrskem delu že pripravil in izoliral študent Jakob Rupert, pri čemer je uporabil vektorja pET28a in pET14b. Zaradi težav pri izolaciji smo se odločili za drug vektorski sistem. Z metodo od ligacije neodvisnega kloniranja LIC smo zapis za ANXA11 wt vstavili v bakterijska ekspresijska vektorja pMCSG7 in pMCSG7-GST. Zanimalo nas je, če lahko fuzija rekombinantnega ANXA11 z oznako GST zmanjša fragmentacijo v procesu izražanja in izolacije proteina. Po uspešnem testnem izražanju ANXA11 v bakterijskih celicah E. coli BL21[DE3] pLysS smo nadaljevali s proizvodnjo v večjem merilu. Proteine smo izolirali z Ni2+- ali glutation-S-transferazno afinitetno kromatografijo. ANXA11 brez oznake GST se je delno fragmentiral, verjetno zaradi nestrukturiranega N-končnega dela, ANXA11 z GST pa se je izkazal kot bolj stabilen. Proteinu ANXA11-GST smo uspešno odcepili oznako His-GST s proteazo TEV. Rekombinante proteine smo dokončno kromatografsko očistili z ločevanjem po velikosti.20192019-09-09 17:55:11Diplomsko delo/naloga109885VisID: 6127COBISS_ID: 1538397379sl