Vezava kalcijevih ionov in njihova potencialna vloga pri regulaciji aktivnosti alfa-aktinina 4Ivanovski, Andrej (Avtor) Pavšič, Miha (Mentor) α-aktinin-4regulacijakalcijITCmetilacijakristalizacijaα-aktinin-4 je citoskeletni protein iz družine spektrinov. Sestavljajo ga tri domene in sicer domena za vezavo aktina ter paličasta in kalmodulinu podobna domena. Aktivno obliko α-aktinina-4 predstavlja antiparalelni homodimer, katerega osrednja vloga je prečno povezovanje aktinskih filamentov, preko tega pa posredno sodeluje pri tvorbi fokalnih stikov in adherentnih pasov. Za razliko od sorodnega α-aktinina-1 je prisoten tudi v nukleoplazmi, kjer naj bi deloval kot transkripcijski faktor številnih genov, vpletenih v tumorske spremembe celic. Sklepamo, da je izooblika 4, podobno kot izooblika 1, regulirana preko vezave kalcijevih ionov. Za α-aktinin-1 je bilo pokazano, da vezava Ca2+-iona povzroči konformacijske spremembe v domeni CaMD, kar povzroči spremembo afinitete do aktina in posledično reorganizacijo aktinskega citoskeleta. Da bi določili afiniteto vezave ionov Ca2+ in podrobneje sturukturno okarakterizirali protein smo pripravili dva proteinska konstrukta: kalmodulinu podobna domena in konstrukt, skrajšan na N-koncu za 45 aminokislinskih ostankov, ki so glede na napoved strukturno neurejeni in lahko kot taki negativno vplivajo na kristalizacijo. Z izotermno titracijsko kalorimetrijo (ITC) smo določili število vezavnih mest za ione Ca2+ na eno domeno (n = 1,19) ter afiniteto vezave (Kd = 474 µM). Za namen kristalizacije smo pripravili tudi metilirano (metilacija lizinskih aminokislinskih ostankov) obliko α-aktinina-4 in preko velikostne izključitvene kromatografije, sklopljene s sipanjem svetlobe, pokazali, da še vedno tvori stabilen homodimer. Naši rezultati predstavljajo dobro osnovo za podrobnejše strukturne in funkcijske raziskave α-aktinina-4.20192019-09-02 11:00:09Diplomsko delo/naloga109428VisID: 6382COBISS_ID: 1538305475sl