Mehansko občutljiv ionski kanal TRPV6 in prenašalec CorA ter njuna umestitev v transficiranih celicah HEK293TŠimunović, Tina (Avtor) Benčina, Mojca (Mentor) Gunčar, Gregor (Komentor) sonogenetikaultrazvokmehansko občutljivi kanalikalcijPrilagajanje na signale iz okolja je ključna lastnost organizmov, ki jim omogoča preživetje. Celice signale sprejemajo preko membranskih proteinov, ki informacijo v notranjost celice posredujejo preko sekundarnih sporočevalcev. Mehansko občutljivi ionski kanali so ključni posredniki pri pretvarjanju mehanskega signala v nihanje koncentracije ionov. Pomembno vlogo sekundarnega sporočevalca imajo kalcijevi ioni, ki sodelujejo v skoraj vseh celičnih procesih, zaradi česar so ti visoko ohranjeni skozi evolucijo. V sklopu magistrskega dela smo želeli preveriti izražanje, delovanje in umestitev mehansko občutljivega kalcijevega kanala znotraj celice. Delo je obsegalo metode molekulskega kloniranja v bakterijskih celicah, transfekcijo sesalskih celic HEK293T, spremljanje jakosti signalov po stimulaciji z ultrazvokom ali kalcijevim ionoforom z luminometrom in umestitev kanala znotraj celice s fluorescenčnim konfokalnim mikroskopom. Pripravili smo genetska konstrukta podganjega mehansko občutljivega ionskega kanala TRPV6 iz naddružine TRP in prenašalca primarno magnezijevih ionov CorA iz glive Aspergillus niger. Genetska konstrukta sestavlja zapis za ionski kanal ali prenašalec, ki smo mu na C-konec dodali hemaglutininsko oznako, samoizrezujoči se peptid T2A in fluorescenčni protein TagBFP. Kot mehanski signal za aktivacijo kanalov smo testirali ultrazvok. Stimulacija z ultrazvokom povzroči odprtje kanalov, kar omogoči prehod kalcijevih ionov v celico, kjer se vežejo na kalcij vezavne proteine in posredno sprožijo izražanje tarčnih genov. Povišanje znotrajcelične koncentracije kalcijevih ionov smo spremljali kot izražanje luciferaze pod od kalcija odvisnim promotorjem NFAT. S kalcijevim ionoforom smo dosegli povišan odziv celic na kemijsko stimulacijo in dokazali, da se zasnovani poročevalski sistem odziva na kalcijeve ione. Celice, ki so izražale TRPV6, so sintetizirale nekoliko več luciferaze kot celice s pcDNA3. Nasprotno je bil odziv znižan v celicah s CorA. Pri stimulaciji z ultrazvokom smo pokazali, da v zasnovanem sistemu TRPV6 ne prispeva k občutljivosti celice, saj je bil odziv celic primerljiv celicam s pcDNA3. Podobno kot prej je pri CorA odziv znižan. S fluorescenčno konfokalno mikroskopijo smo pokazali, da se TRPV6 umešča na celično membrano, zaznamo pa ga tudi v znotrajceličnih organelih. Večinoma je na endosomih in v okolici jedra. CorA je v znotrajceličnih organelih. Celice, ki so izražale TRPV6 ali CorA, niso bolj občutljive na ultrazvočno stimulacijo od nespremenjenih celic HEK293T. Zasnovani sistem ni občutljiv na ultrazvok, kar bi bilo smiselno podrobneje preučiti v nadaljnjih raziskavah, saj ultrazvok, kot neinvazivno orodje za aktivacijo celic in globokih tkiv, pridobiva na prepoznavnosti in možnosti uporabe v sintezni biologiji, diagnostiki in terapiji.20192019-08-28 12:55:07Magistrsko delo/naloga109237VisID: 5031COBISS_ID: 1538321603sl