Priprava avksotrofnih mutant kvasovke Aureobasidium pullulans s tehnologijo CRISPR-Cas9Buh, Tajda (Avtor) Turk, Martina (Mentor) Aureobasidium pullulansCRISPR-Cas9triptofanski avksotrofAureobasidium pullulans je filamentozna gliva s kvasno obliko. Zaradi sposobnosti preživetja v ekstremnih pogojih je zanimiva za proučevanje in uporabo v industriji. Cilj magistrskega dela je bil pripraviti triptofanski avksotrofni sev Aureobasidium pullulans s sistemom CRISPR-Cas9, razvitim za uporabo v Aspergillus nidulans in nekaterih drugih filamentoznih glivah. Prekiniti smo želeli gen ApTRP1 z zapisom za encim fosforibozilantranil izomerazo, ki je tretji encim v sintezni poti triptofana. S prekinitvijo sinteze te esencialne aminokisline smo onemogočili rast in preživetje celice v odsotnosti triptofana. S sistemom CRISPR-Cas9 smo inducirali dvojni prelom DNA v predelu promotorja pred genom ApTRP1. V postopku popravljanja, usmerjenega s homologno rekombinacijo, je celica v genom vnesla zaporedje z zapisom za odpornost proti bleomicinu. Izbitje gena ApTRP1 oz. vgradnjo bleomicinske kasete smo zasledovali s protiselekcijo s 5-fluoroantranilno kislino, reakcijo PCR in rastjo na ploščah s oz. brez triptofana. Prekinjen gen ApTRP1 smo potrdili le z rastjo mutant na selekcijskem gojišču s 5-fluoroantranilno kislino. S primerjavo rasti na gojišču s triptofanom in brez njega ter reakcijo PCR izbitja ApTRP1 nismo uspeli potrditi.20192019-08-28 10:05:07Magistrsko delo/naloga109235VisID: 2755COBISS_ID: 1538321091sl