Vpliv izbranih peptidnih in proteinskih inhibitorjev na aktivnost nekaterih algnih metakaspaz tipov I, II in IIIKlemenčič, Polona (Avtor) Klemenčič, Marina (Mentor) metakaspazaproteolizainhibicijaserpinProteaze so hidrolaze, ki jih najdemo pri rastlinah, živalih in mikroorganizmih in omogočajo znotrajcelično in zunajcelično razgradnjo proteinov. V splošnem jih delimo v štiri večje skupine, in sicer metaloproteaze, aspartatne, serinske in cisteinske proteaze. Aktivnost slednjih kontrolirajo njihovi endogeni inhibitorji, najbolj pogosti so cistatini, tiropini in α2-makroglobulin. Vrsta cisteinskih proteaz so tudi kaspaze. V celicah so prisotne kot prokaspaze v neaktivni obliki. Za njihovo aktivacijo je nujna proteolitična cepitev na dveh mestih. Metakaspaze so edini kaspazni homologi, ki poleg domene p20 vsebujejo tudi domeno p10. Od kaspaz se razlikujejo po tem, da za svojo katalitično aktivnost ne potrebujejo oligomerizacije. Metakaspaze najdemo pri glivah, praživalih in rastlinah. Sodelujejo v procesu programirane celične smrti in uravnavajo celično homeostazo. Glede na položaj domen p20 in p10 v polipeptidni verigi poznamo metakaspaze tipa I, tipa II in zaenkrat še najmanj raziskan, tip III. Namen moje diplomske naloge je bil ugotoviti, kako intenzivno različni inhibitorji zavirajo aktivnost posameznega tipa metakaspaze. Uporabili smo metakaspazo tipa II, CrMC2, iz alge Chlamydomonas reinhardtii ter metakaspazo tipa I, GtMC1, in metakaspazo tipa III, GtMC2, iz organizma Guillardia theta. Preizkusili smo sedem različnih inhibitorjev: antipain, levpeptin, E-64, FFR-CMK, Z-VAD, PMSF in serpin. Teste encimskih aktivnosti smo izvedli pri pH 8,0 v prisotnosti kalcijevih ionov. Aktivnost encima smo spremljali z merjenjem fluorescence, pri čemer smo kot substrat uporabili FR-AMC. Rezultati so pokazali, da so vsi inhibitorji razen serpina podobno učinkovito zavirali delovanje posameznega tipa metakaspaze. Serpin je učinkovito zaviral le delovanje GtMC1. Kot najmočnejši inhibitor vseh treh tipov metakaspaz se je izkazal FFR-CMK, sledita pa mu antipain in levpeptin. Na podlagi naše raziskave lahko trdimo, da GtMC1, CrMC2 in GtMC2 najmanj zavirajo inhibitorji PMSF, E-64 in Z-VAD.20192019-08-05 09:45:11Diplomsko delo/naloga108919VisID: 6148COBISS_ID: 1538294211sl