Biokemijsko vrednotenje mehanizma delovanja kovalentnih zaviralcev encima MurAKošutić, Maja (Avtor) Hrast, Martina (Mentor) kovalentni zaviralciireverzibilne interakcijeencim MurAencimska kinetikaprotibakterijske učinkovineUDP-N-acetilglukozamin enolpiruvil transferaza(MurA)je znotrajcelični encim, ki je udeležen v prvi stopnji sinteze peptidoglikana, bistvenega gradnika celične stene bakterij. Encima ne najdemo v človeškemu telesu, zato predstavlja zanimivo in tudi že validirano tarčo za zdravljenje bakterijskih okužb. Protibakterijska učinkovina fosfomicin je trenutno edini znani zaviralec MurA, ki se uporablja v klinični praksi. Kot pri mnogih drugih protibakterijskih učinkovinah se je tudi pri fosfomicinu že razvila bakterijska odpornost, zato potekajo prizadevanja za odkritje novih zaviralcev, ki bi z delovanjem na znotrajcelično stopnjo sinteze peptidoglikana zavrli nastanek bakterijske celične stene in tako delovali baktericidno. V sklopu magistrske naloge smo z različnimi biokemijskimi preskušanji ovrednotili okoli 100 spojin. Spojine smo pridobili iz različnih virov. V večini primerov je šlo za majhne elektrofilne fragmente, za katere smo pri preskušanjih želeli ugotoviti ali uspešno zavirajo encim MurA in ali se na encim vežejo kovalentno. Ključna ugotovitev naloge je bila določitev spojin primernih za nadaljnje raziskovanje in optimizacijo do morebitnih protibakterijskih učinkovin. Rezidualno aktivnost pod 50 % smo določili okoli 70 spojinam. Tem smo z dodatnimi testi določili tudi vrednosti IC50. Glede na vrednost IC50 je najmočnejši zaviralec spojina 51, 4-nitrobenzen-1-tiol, z vrednostjo 0,125 ?M. Ireverzibilen način zaviranja smo določali s testom časovne odvisnosti vezave in redčenja. Ugotovili smo, da ireverzibilen način vezave nakazuje 14 spojin. Pri delu vrednotenih spojin (29–52) smo želeli določiti tudi kinetične parametre značilne za ireverzibilen tip zaviranja. Zaradi velike reaktivnosti spojin nam to ni uspelo. Pri spojinah, ki niso nakazovale ireverzibilnega delovanja smo preko reverzibilne encimske kinetike s hitrostjo reakcij ugotavljali vrsto vezave. Pri spojini 36 smo določili kompetitivni reverzibilni način vezave na encim. Spojin 53–101 nismo kinetično vrednotili. Določili pa smo, da so med temi za nadaljnja preskušanja ireverzibilnosti najprimernejše spojine 58, 59, 60, 64, 85 in 90.20192019-06-28 09:29:11Magistrsko delo/naloga108341VisID: 67305sl