Protitumorski učinek elektrokemoterapije s cisplatinom ali oksaliplatinom v kombinaciji z genskim elektroprenosom plazmida z zapisom za interlevkin-12 na mišjem modelu melanomaUršič, Katja (Avtor) Serša, Gregor (Mentor) elektrokemoterapijagenski elektroprenosinterlevkin 12melanomZnanstveno izhodišče: Za razliko od začetnih stadijev raka, zaradi agresivnosti in odpornosti na terapije uspešnost zdravljenja malignega melanoma še vedno ne dosega pričakovanj. Novi terapevtski pristopi temeljijo predvsem na kombiniranju že uveljavljenih terapij z novejšimi terapijami, ki vplivajo na komponente imunskega sistema. Medtem ko je elektrokemoterapija s cisplatinom že dobro uveljavljena v kliniki, elektrokemoterapija z oksaliplatinom do danes še ni bila raziskana. Oksaliplatin je primeren kandidat za vpeljavo v elektrokemoterapijo zaradi podobnosti s cisplatinom, opisanih manjših stranskih učinkov in predpostavljeno večjega imunomodulatornega vpliva. Čeprav v kliniki z elektrokemoterapijo pri 80 % tumorjev dosežemo lokalno tumorsko kontrolo, protitumorski učinek na oddaljene nezdravljene tumorje in/ali metastaze (t. i. »abscopal effect«) še ni bil opisan. Namen doktorske naloge je bil preučiti učinkovitost intratumoralne elektrokemoterapije z oksaliplatinom in jo primerjati z elektrokemoterapijo s cisplatinom na mišjem malignem melanomu B16F10. Preverili smo tudi, v kolikšni meri lahko peritumoralni genski elektroprenos plazmida z zapisom za interlevkin-12 (IL-12) poveča lokalno učinkovitost elektrokemoterapije in ali lahko spodbudi tudi sistemski odgovor, to je protitumorski učinek na oddaljene nezdravljene tumorje. Metode: Raziskave so potekale na celični liniji mišjega malignega melanoma B16F10. V prvem, in vitro delu smo raziskali, ali električni pulzi potencirajo privzem citostatika oksaliplatina v celice ter vezavo platine na DNA. Vsebnost platine v vzorcih smo izmerili s pomočjo masne spektrometrije z induktivno sklopljeno plazmo. Zanimala nas je tudi potenciacija v citotoksičnosti ob aplikaciji električnih pulzov in primerjava občutljivosti celic B16F10 na oksaliplatin in cisplatin. Dokazali smo jo s testom klonogenosti. Citometrično smo določili vrsto celične smrti oziroma delež celic, ki umirajo z apoptozo, nekrozo ali imunogeno celično smrtjo. Nadaljevali smo s poskusi na miših C57Bl/6. Tumorske celice mišjega melanoma B16F10 so po injiciranju v podkožje na boku miši tvorile čvrste tumorje. S terapijo smo začeli, ko so tumorji dosegli 3540 mm3. Preverili smo protitumorsko učinkovitost elektrokemoterapije z oksaliplatinom in jo primerjali z elektrokemoterapijo s cisplatinom. Kombinirano terapijo sta sestavljala peritumoralni genski elektroprenos plazmida z zapisom za IL-12 in intratumoralna elektrokemoterapija s cisplatinom ali oksaliplatinom. Najprej smo izvedli genski elektroprenos, in sicer tako, da smo v štiri mesta peritumoralno intradermalno injicirali plazmid (skupaj 50 µg). Nizkonapetostne električne pulze (12 pulzov, 170 V/cm, 150 ms, 0,4/1,39 Hz) smo dovedli z več-točkovno elektrodo (MEA) s krožno razporeditvijo šestih elektrodnih konic takoj po injiciranju plazmida. Pet minut po genski terapiji smo intratumoralno injicirali cisplatin ali oksaliplatin, po dveh minutah pa dovedli električne pulze s ploščatimi elektrodami (8 pulzov, 1300 V/cm, 100 µs, 1 Hz). Preverili smo, ali dodatne ponovitve genskega elektroprenosa IL-12 izboljšajo protitumorski učinek kombinirane terapije. Za določanje sistemskega vpliva kombinirane terapije oziroma vpliva na oddaljene nezdravljene tumorje smo uvedli model za sistemsko bolezen. Tumorske celice smo injicirali v oba boka živali; v desni bok 1 x 106 celic, v levi bok pa 0,7 x 106 celic. Med izvedbo elektrokemoterapije in genskega elektroprenosa so bile miši pod inhalacijsko anestezijo z izofluranom. Zdravili smo desni tumor, zaostanek v rasti pa spremljali na obeh tumorjih, zdravljenem in nezdravljenem. Protitumorski učinek oziroma zaostanek v rasti tumorjev smo spremljali s kljunastim merilom. Za določanje koncentracije IL-12 v serumu, vsebnosti platine v tumorjih in serumu ter histološko analizo smo po humani usmrtitvi živali odvzeli tumorje in kri. Imunohistokemijsko smo označili nekrozo in apoptozo (kaspaza 3), izražanje transgena (IL-12) in populacije imunskih celic v tumorju (grancim B, Foxp3). Rezultati: Citotoksičnost oksaliplatina v kombinaciji z električnimi pulzi je bila visoka in primerljiva s citotoksičnostjo cisplatina na celicah mišjega melanoma B16F10 in vitro. Primerljiva citotoksičnost je bila posledica primerljive potenciacije v privzemu platine v celice in vezavi platine na DNA. Na melanomskem modelu in vivo smo pokazali, da je elektrokemoterapija z oksaliplatinom enako učinkovita kot elektrokemoterapija s cisplatinom, če dozo oksaliplatina dvignemo za faktor 1,6. Izpostavitev melanomskih celic elektrokemoterapiji z oksaliplatinom ali cisplatinom je vodila tudi v imunogeno celično smrt, slednje pa je koreliralo s povišano infiltracijo imunskih celic v tumor po terapiji. Po elektrokemoterapiji z nizkimi dozami oksaliplatina ali cisplatina smo opazili le zaostanek v rasti primarnih tumorjev, ne pa tudi popolnih odgovorov. Pokazali smo, da peritumoralni genski elektroprenos plazmida z zapisom za IL-12 potencira protitumorski učinek intratumoralne elektrokemoterapije s cisplatinom ali oksaliplatinom na mišjem malignem melanomu B16F10. Ob enako učinkoviti elektrokemoterapiji s cisplatinom ali oksaliplatinom je bil prispevek genskega elektroprenosa IL-12 večji pri elektrokemoterapiji s cisplatinom, dosegli smo namreč 38 % popolnih odgovorov. Po kombinirani terapiji z oksaliplatinom smo opazili le značilen zaostanek v rasti tumorjev. Dodatno ponavljanje genskega elektroprenosa plazmida z zapisom za IL-12 ni izboljšalo terapevtskega učinka, povzročilo je tudi infiltracijo peritumoralnega prostora s celicami T zaviralkami. Najpomembneje, kombinirana terapija, pri kateri smo za elektrokemoterapijo uporabili cisplatin, je imela poleg lokalnega tudi sistemski učinek, dvodnevni zaostanek v rasti oddaljenih nezdravljenih tumorjev. Za uspešnost opisane kombinirane terapije je najverjetneje odgovorno lokalno in sistemsko spodbujanje imunskega odziva. Po kombinirani terapiji s cisplatinom v elektrokemoterapiji smo namreč v zdravljenih in nezdravljenih tumorjih opazili imunske celice, pozitivne za grancim B. Zaključki: Genski elektroprenos plazmida z zapisom za IL-12 je učinkovit pri spodbujanju lokalnega protitumorskega učinka elektrokemoterapije. Poleg tega ima kombinirana terapija, pri kateri smo za elektrokemoterapijo uporabili cisplatin, tudi sistemski protitumorski učinek. Rezultati doktorske naloge bodo v pomoč pri vpeljevanju oksaliplatina v elektrokemoterapijo, kot samostojno terapijo, v kliniko. Rezultati v sklopu testiranja kombinirane terapije pa bodo osnova za prehod na naslednjo stopnjo v verigi translacijskih raziskav, prijavo klinične študije.20192019-06-14 07:15:04Doktorsko delo/naloga108055VisID: 11619COBISS_ID: 301648384sl