Pridobivanje glikozid hidrolaze 10 iz metagenoma komposta in ugotavljanje njenih lastnostiZupančič, Viktor (Avtor) Vodovnik, Maša (Mentor) encimiglikozid hidrolazaGH10ksilanazaheterologno izražanjebiokemijska karakterizacija encimovksilanmetagenom kompostaMetagenomski pristop iskanja novih biotehnološko zanimivih encimov temelji na pregledu celokupne DNA kompleksnih okoljskih vzorcev, čemur sledi kloniranje in izražanje tarčnih genov v dobro poznanih in z vidika gojenja nezahtevnih ekspresijskih sevih. Med iskane encime uvrščamo tudi glikozid hidrolaze, ki razgrajujejo kompleksne rastlinske polisaharide. V magistrski nalogi smo se osredotočili na izolacijo in karakterizacijo produkta izbranega gena (xyl6) z zapisom za domnevno glikozid hidrolazo iz družine 10 (GH10), identificiranega v metagenomu komposta. Izolirali smo encim z molekulsko maso približno 40 kDa, z aktivnostjo na substratih bukovem ksilanu in arabinoksilanu. Temperaturni optimum delovanja izoliranega encima na bukovem ksilanu v 50 mM K-fosfatnem pufru s pH 8 je pri temperaturi 50 °C. Ugotovili smo, da kovinski ioni Co2+, Fe3+, Mn2+ ali Ca2+ v koncentracijah 5 mmol/L povečajo aktivnost preučevanega encima, v koncentracijah 10 mmol/L pa jo zmanjšajo. Aktivnost encima popolnoma inhibirajo ioni Cu2+ v koncentraciji 10 mmol/L. Aktivnost tarčnega encima se zmanjša tudi v prisotnosti NaCl v koncentracijah nad 100 mmol/L, ob prisotnosti 10 % (v/v) metanola, etanola ali acetona ter 20 mM EDTA ali SDS. Prav tako encim ni stabilen pri temperaturah nad 50 °C ter v kislih pogojih (pod pH 6). Povečano aktivnost preučevanega encima smo zaznali v prisotnosti reducentov, 2 mM DTT ali 10 mM ß-merkaptoetanola. Ugotavljali smo tudi kinetične parametre tarčnega encima pri optimalnih pogojih delovanja na bukovem ksilanu in ocenili vrednosti Vmax na 787,2 ± 12,9 μmol/min/mg, Km na 1,8 ± 0,3 mg/mL in kcat na 526,2 ± 17,4 s-1. Pokazali smo tudi, da je ksilanaza Xyl6 sposobna razgraditi tudi s hemicelulozo bogate materiale, kot so pšenični ali ječmenovi otrobi, zaradi česa je potencialno biotehnološko zanimiv encim.[V. Zupančič]20192019-04-04 07:45:10Magistrsko delo/naloga107362UDK: 604.4:577.152.3:575.112VisID: 163582COBISS_ID: 5041784sl